Preservare le sinapsi neuromuscolari nella SLA stimolando la MuSK con un anticorpo agonista terapeutico

Abstract

Nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e nei modelli animali di SLA, tra cui i topiSOD1-G93Amice, lo smontaggio della sinapsi neuromuscolare precede la perdita dei motoneuroni ed è sufficiente a causare un declino della funzione motoria che culmina in una paralisi respiratoria letale. Abbiamo trattatoSOD1-G93Amice con un anticorpo agonista per MuSK, un recettore tirosina chinasi essenziale per il mantenimento delle sinapsi neuromuscolari, per determinare se l'aumento della segnalazione retrograda del muscolo rallenterebbe il distacco terminale del nervo dal muscolo. L'anticorpo agonista, somministrato dopo l'insorgenza della malattia, ha rallentato la denervazione muscolare, promuovendo la sopravvivenza dei motoneuroni, migliorando l'uscita del sistema motorio e prolungando la durata della vita dei topiSOD1-G93Amice. Questi risultati suggeriscono una nuova strategia terapeutica per la SLA, utilizzando un formato anticorpale con precedenza clinica, che ha come obiettivo un percorso essenziale per mantenere l'attaccamento dei terminali nervosi al muscolo.

Introduzione

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa che progredisce senza sosta da un sottile declino della funzione motoria a una paralisi respiratoria letale entro pochi anni dalla diagnosi (Pasinelli e Brown, 2006; Taylor et al., 2016). La malattia può essere familiare e causata da mutazioni dominanti in uno dei vari geni, tra cui SOD1, C9orf72, TDP43 e FUS (Taylor et al., 2016). Più comunemente, tuttavia, la malattia è idiopatica.

Sebbene la morte delle cellule motoneuronali sia una caratteristica distintiva della SLA, la perdita delle sinapsi neuromuscolari avviene prima della perdita dei motoneuroni ed è la causa primaria della paralisi motoria sia nelle forme familiari che sporadiche della SLA (Fischer et al., 2004; Schaefer et al., 2005; Pun et al., 2006). Il distacco dei terminali dei nervi motori e il ritiro degli assoni motori ha ricevuto meno attenzione rispetto alla successiva perdita dei motoneuroni, ma gli approcci terapeutici progettati per preservare le sinapsi neuromuscolari hanno il potenziale di mantenere la funzione motoria, soprattutto durante le prime fasi della malattia, e di fornire un beneficio alla qualità della vita del paziente e della famiglia.

I topi transgenici portatori di mutazioni dominanti nel gene SOD1 umano, compresi i topi SOD1-G93A, ricapitolano le caratteristiche distintive della SLA e forniscono il modello animale più studiato per la SLA (Vinsant et al., 2013a; Vinsant et al., 2013b). Inoltre, poiché il distacco dei terminali dei nervi motori è la causa principale della paralisi nei topi SOD1-G93A, i topi SOD1-G93A rappresentano un modello clinicamente rilevante per la SLA.

I percorsi di segnalazione che controllano l’attacco dei terminali degli assoni motori al muscolo stanno solo iniziando a essere compresi, ma due geni, Lrp4 e Muschio, espressi dal muscolo, giocano un ruolo importante. Lrp4, un membro della famiglia dei recettori LDL, è il recettore muscolare per il ligando neuronale critico, Agrin (Kim et al., 2008; Zhang et al., 2008). Dopo aver legato Agrin, Lrp4 si associa con MuSK, un recettore tirosina chinasi, stimolando MuSK e portando all’ancoraggio e alla migliore espressione delle proteine critiche postsinaptiche, tra cui Lrp4 (Burden et al., 2013). Clustered Lrp4 poi segnala di nuovo agli assoni motori per stimolare il loro attaccamento e la differenziazione (Yumoto et al., 2012).

Mutazioni recessive in Agrin, Lrp4 o Musk causano miastenia congenita, un gruppo di disturbi neuromuscolari, distinti dalla SLA, che compromettono la struttura e la funzione delle sinapsi neuromuscolari e portano a debolezza e fatica muscolare (Engel et al., 2015). Inoltre, gli autoanticorpi di Agrin, Lrp4, o MuSK causano miastenia gravis (MG), che è anche distinta dalla SLA (Gilhus e Verschuuren, 2015). Nel MuSK MG, gli anticorpi patogeni sono di solito diretti verso il primo dominio Ig-like in MuSK e riducono la fosforilazione MuSK compromettendo il legame tra Lrp4 e MuSK (Huijbers et al., 2013; Koneczny et al., 2013).

Anche se i difetti nel percorso di segnalazione MuSK non sono associati alla SLA, l’aumento dell’espressione del gene MuSK stabilizza le sinapsi neuromuscolari nei topi SOD1-G93A, riducendo l’estensione della denervazione muscolare e migliorando la funzione motoria (Pérez-García e Burden, 2012). Tuttavia, questi esperimenti hanno utilizzato topi transgenici per aumentare modestamente l’espressione del MuSK dal muscolo, iniziando durante lo sviluppo precoce, diversi mesi prima dell’insorgenza della malattia. Pertanto, il potenziale terapeutico dell’aumento della segnalazione di MuSK come strategia per ridurre la denervazione e migliorare la funzione motoria nei pazienti con diagnosi di SLA è rimasto poco chiaro. In questo caso, abbiamo cercato di determinare se un approccio farmacologico per aumentare l’attività della MuSK in vivo avrebbe preservato le sinapsi neuromuscolari nei topi SOD1-G93A quando il dosaggio è stato avviato dopo l’insorgenza della malattia. Questo tipo di approccio avrebbe migliorato sostanzialmente il potenziale di traduzione nei pazienti affetti da SLA senza i complessi requisiti della terapia genica (Miyoshi et al., 2017).

Risultati

Anticorpi agonisti per MuSK

Uno studio precedente ha identificato ventuno anticorpi a catena singola (scFvs) che riconoscono il MuSK dei topi e ha sollevato l’idea che un sottoinsieme di questi anticorpi possa funzionare come agonisti MuSK in vivo (Xie et al., 1997). Abbiamo studiato l’attività di due anticorpi, #13 e #22, riportati per stimolare il MuSK nei miotoubi in coltura, così come l’anticorpo #21, riportato per legare ma non per stimolare il MuSK. Abbiamo confermato che gli anticorpi #13 e #22, re-ingegnerizzati come molecole umane IgG1, hanno stimolato la fosforilazione della tirosina MuSK nella linea di cellule muscolari di topo C2 (Figura 1A), mentre l’anticorpo #21, così come un anticorpo IgG1 di controllo per il polline di ambrosia, non è riuscito a stimolare la fosforilazione MuSK (Figura 1A).

Agrin stimola la fosforilazione MuSK legando Lrp4, che promuove l’associazione tra Lrp4 e MuSK, richiedendo il primo dei tre domini Ig-like in MuSK (Zhang et al., 2011). In contrasto con il meccanismo Agrin-dipendente per l’attivazione di MuSK, l’anticorpo agonista lega il dominio Fz-like in MuSK, forza-dimerizzando e stimolando la fosforilazione MuSK, indipendentemente dalla Lrp4 (Figura 1B,C e Figura 1-figure supplement 1). È importante notare che il dominio Fz-like è dispensabile per la formazione di sinapsi nei topi (Remédio et al., 2016).

Gli anticorpi agonisti MuSK impegnano il MuSK in vivo

Per determinare se l’anticorpo agonista n. 13 potesse coinvolgere il MuSK in vivo, abbiamo iniettato per via intraperitoneale (IP) quantità variabili dell’anticorpo agonista MuSK su una spina dorsale IgG1 umana, o un anticorpo IgG1 umano di controllo per il polline di ambrosia, in topi di tipo selvatico. Alcuni giorni dopo, abbiamo colorato interi montaggi del muscolo del diaframma per determinare se l’anticorpo agonista ha assunto l’anticorpo MuSK alla sinapsi. Figura 2A mostra che le sinapsi neuromuscolari sono stati etichettati specificamente dall’anticorpo agonista MuSK. MuSK colorazione era evidente già 3 giorni (Figura 2Aiv-vi), e la colorazione persisteva per almeno 7 giorni dopo la singola iniezione (Figura 2A, vii-ix). L’organizzazione di AChR e terminali nervosi apparve normale (Figura 2A,ii,v,viii), indicando che l’anticorpo agonista MuSK non ha disturbato le caratteristiche principali della differenziazione sinaptica. Inoltre, l’osservazione visiva dell’anticorpo iniettato nei topi non ha rivelato anomalie comportamentali evidenti, indicando che l’anticorpo agonista MuSK era ben tollerato dai topi. Due mg / kg di anticorpo agonista era sufficiente per saturare l’etichettatura MuSK alla sinapsi (Figura 2B) e aumentare MuSK tirosina fosforilazione in vivo (Figura 1-figure supplemento 1).

Abbiamo misurato le proprietà farmacocinetiche dell’anticorpo iniettato e abbiamo trovato che l’emivita dell’anticorpo iniettato nel sangue era di ~12 giorni (Figura 2C). L’anticorpo ha mostrato una clearance lineare per 21 giorni dopo l’iniezione dell’anticorpo, indicando che l’esposizione poteva essere mantenuta per diverse settimane. Inoltre, questi risultati hanno dimostrato che il sistema immunitario del topo non riconosceva e cancellava l’anticorpo, che conteneva una regione Fc umana, dalla circolazione durante questo periodo di tre settimane (Figura 2C).

Una singola dose di anticorpo agonista MuSK diminuisce la denervazione nei topi SOD1-G93A

Abbiamo studiato i topi SOD1-G93A femmina e maschio, su uno sfondo C57BL/6, con 21-26 copie del gene SOD1-G93A umano (Figura 3-figure supplemento 1). Nei topi SOD1-G93A, denervazione dei muscoli degli arti inizia a P50, mentre la denervazione del muscolo del diaframma inizia un mese dopo (Pun et al., 2006; Rocha et al., 2013). Poiché la denervazione del muscolo del diaframma è responsabile della paralisi respiratoria letale, abbiamo concentrato la nostra analisi sull’innervazione di questo muscolo. Abbiamo prima quantificato l’entità dell’innervazione nel muscolo del diaframma a P90 colorando per i terminali nervosi e AChR postsinaptici, che rimangono anche nei siti sinaptici denervati (Figura 3A). Denervazione era evidente nei topi SOD1-G93A già nel P90 (Figura 3B,C). Da P90 a P110, l’estensione della innervazione completa, definita come perfetta applicazione dei terminali nervosi e la membrana postsinaptica ricca di AChR, è diminuita dal 77,3% al 18,1% nella femmina e dal 53,1% al 16,1% nei topi maschi SOD1-G93A (Figura 3B). Allo stesso modo, l’entità della denervazione completa è aumentata dal 2,3% al 41% nelle femmine e dal 16,7% al 24,4% nei topi maschi SOD1-G93A in questo periodo di venti giorni (Figura 3C).

SOD1-G93A topi sono stati iniettati con l’anticorpo agonista MuSK a P90. Poiché l’anticorpo aveva un tempo di dimezzamento di 12 giorni e 2 mg / kg di anticorpi saturi MuSK alla sinapsi (Figura 2B,C), abbiamo iniettato topi SOD1-G93A con 10 mg / kg di anticorpo agonista, garantendo che la concentrazione di anticorpi nel sangue rimarrebbe a livelli di saturazione per il legame MuSK nel periodo di 20 giorni. Abbiamo scoperto che una singola dose dell’anticorpo agonista MuSK ha aumentato il numero di sinapsi completamente innervate di 2,7- e 2,5 volte nei topi SOD1-G93A femmina e maschio, rispettivamente, e diminuito il numero di sinapsi completamente denervate di 3,7- e 2,3 volte nei topi SOD1-G93A femmina e maschio, rispettivamente (Figura 3B,C). Questi risultati hanno dimostrato che l’anticorpo agonista MuSK, introdotto dopo l’insorgenza della malattia, ha diminuito il ritiro dell’assone motorio dal muscolo del diaframma.

Il dosaggio cronico con l’anticorpo agonista MuSK arresta l’ulteriore denervazione nei topi SOD1-G93A per oltre due mesi

Per determinare se l’anticorpo agonista MuSK potesse preservare le sinapsi neuromuscolari per un periodo di tempo più lungo, abbiamo dosato cronicamente i topi SOD1-G93A. Per evitare il riconoscimento dell’ospite e la clearance dell’anticorpo durante l’esposizione cronica, abbiamo usato un anticorpo MuSK #13 su una spina dorsale IgG2a murina che mancava anche di funzioni effettori (Lo et al., 2017). La capacità di questa ‘chimera inversa’ di legare e stimolare il MuSK era simile all’anticorpo con una spina dorsale IgG umana (Figura 4-figure supplement 1). Inoltre, la ‘chimera inversa’ aveva un tempo di dimezzamento simile all’anticorpo umano agonista in vivo (Figura 4-figure supplement 2).

SOD1-G93A topi sono stati iniettati con 10 mg / kg di anticorpo agonista chimera inversa a P90 e ogni 24 giorni dopo, e abbiamo sacrificato topi cronicamente iniettato ogni 24 giorni per quantificare l’innervazione del muscolo del diaframma (Figura 4A). Poiché 2 mg / kg di anticorpo saturo MuSK alla sinapsi e perché l’anticorpo aveva un emivita di 11 giorni nel sangue, questo programma di dosaggio ha assicurato che i livelli di saturazione dell’anticorpo agonista MuSK sono stati mantenuti in ogni momento (Figura 4-figure supplemento 2).

Nei topi SOD1-G93A iniettati con un anticorpo di controllo contro GP120, la perdita sinaptica ha continuato a diminuire da P114 a P162, cosicché solo l’11% delle sinapsi è stato completamente innervato a P162 (Figura 4B). Questa perdita progressiva è stata arrestata dall’iniezione dell’anticorpo agonista MuSK, in quanto il numero di sinapsi completamente innervate è rimasto sostanzialmente invariato (40-50%) da P114 a P162 nei topi SOD1-G93A iniettati con l’anticorpo agonista MuSK (Figura 4B). Allo stesso modo, il numero di sinapsi completamente denervate ha continuato ad aumentare da P114 a P162 nei topi SOD1-G93A iniettati con l’anticorpo di controllo, mentre questo aumento progressivo è stato impedito dall’anticorpo agonista MuSK (Figura 4C). Questi risultati indicano che l’anticorpo agonista MuSK ha impedito un’ulteriore perdita sinaptica e ha preservato le sinapsi per almeno 50 giorni dopo che i segni di denervazione e la malattia erano evidenti nei topi SOD1-G93A.

Durante la progressione della malattia, la transizione sinapsi attraverso una fase parzialmente innervata, quando solo una parte della membrana postsinaptica ricca di AChR è apposto da terminali del nervo motore (Figura 4-figure supplemento 3). Anche se il numero di sinapsi parzialmente innervate era simile in topi SOD1-G93A iniettato con il controllo o anticorpo agonista MuSK (Figura 4-figure supplemento 3), l’estensione della copertura dei terminali nervosi era del 34% in più a sinapsi parzialmente innervate in topi iniettati con l’anticorpo agonista MuSK (Figura 4-figure supplemento 3). Così, l’anticorpo agonista MuSK agonista ha aumentato sia l’innervazione completa così come la copertura terminale del nervo a sinapsi parzialmente innervate in topi SOD1-G93A.

Migliorata l’uscita del sistema motorio del muscolo del diaframma

Per determinare se il mantenimento delle sinapsi neuromuscolari ha portato ad un miglioramento dell’uscita del sistema motorio, abbiamo usato un ex-vivo preparazione del nervo frenico e del muscolo diaframma per misurare i potenziali d’azione del muscolo composto (CMAP), in seguito alla stimolazione del nervo frenico. Abbiamo studiato i topi SOD1-G93A tre o quattro settimane prima della fase finale (Figura 5). Abbiamo stimolato il nervo frenico al muscolo del diaframma e registrato CMAPs, che provocano la contrazione muscolare (Figura 5-figure supplemento 1). Abbiamo trovato nessuna differenza significativa nell’ampiezza del primo CMAP tra i topi SOD1-G93A iniettati con l’anticorpo agonista MuSK o l’anticorpo di controllo per GP120 (anti-GP120 maschi trattati: 5.95 ± 1,14 mV; maschi trattati anti-MuSK: 5,93 ± 0,52 mV; femmine trattate anti-GP120: 4,95 ± 0,54 mV; femmine trattate anti-MuSK: 5,81 ± 0,63 mV). Abbiamo poi misurato l’affidabilità della trasmissione sinaptica alla giunzione neuromuscolare stimolando ripetutamente il nervo frenico ad una frequenza fisiologica (20 Hz). Abbiamo trovato un rapido e grave declino nell’ampiezza del CMAP, indicativo di disfunzione sinaptica e denervazione, in topi SOD1-G93A cronicamente iniettato con l’anticorpo di controllo GP120. Al contrario, il declino dell’ampiezza del CMAP è stato molto meno grave nei topi SOD1-G93A trattati con l’anticorpo agonista MuSK, dimostrando che l’anticorpo agonista MuSK ha migliorato la funzione neuromuscolare (Figura 5). Inoltre, la stimolazione ripetitiva del nervo frenico ad una frequenza più impegnativa (50 Hz) ha portato a frequenti fallimenti di suscitare un CMAP nei topi SOD1-G93A iniettati con l’anticorpo di controllo GP120. Tali fallimenti sono stati meno frequenti nei topi SOD1-G93A iniettati con l’anticorpo agonista MuSK, simile ai topi selvatici (Figura 5). Questi guasti CMAP sono probabilmente dovuti a meccanismi presinaptici, come il blocco di conduzione o il rilascio di neurotrasmettitori compromessi, piuttosto che l’incapacità delle piastre terminali del motore per generare un potenziale d’azione. In entrambi i casi, il mantenimento delle sinapsi neuromuscolari, stimolato dall’anticorpo agonista MuSK, ha portato ad una migliore affidabilità della trasmissione sinaptica e l’uscita del muscolo diaframmatico di importanza critica nei topi SOD1-G93A.

Anticorpo agonista MuSK diminuisce la perdita di motoneuroni nei topi SOD1-G93A

Abbiamo poi valutato se la conservazione delle sinapsi neuromuscolari nei topi SOD1-G93A ha ridotto la morte dei motoneuroni. Durante lo sviluppo embrionale la morte del motoneurone è regolata dall’innervazione e ridotta quando i motoneuroni fanno sinapsi aggiuntive con il muscolo (Hollyday e Hamburger, 1976; Tanaka e Landmesser, 1986; Landmesser, 1992), mentre la sopravvivenza dei motoneuroni adulti è meno dipendente dall’innervazione muscolare (Lowrie e Vrbová, 1992). Abbiamo quantificato il numero di motoneuroni, colorati per l’acetiltrasferasi colina (ChAT), nel midollo spinale lombare dei topi SOD1-G93A iniettati cronicamente con l’anticorpo di controllo per GP120 o l’anticorpo agonista MuSK (Figura 6A). L’anticorpo agonista MuSK ha aumentato il numero di motoneuroni del 31% al 57% a P138 (Figura 6B), durante il periodo di picco della morte delle cellule motoneuronali nei topi SOD1-G93A quando circa la metà dei motoneuroni spinali sono stati persi (Vinsant et al., 2013a). Questi risultati dimostrano che l’aumento della segnalazione retrograda dopo l’insorgenza della malattia non solo preserva le sinapsi neuromuscolari, ma promuove anche la sopravvivenza dei motoneuroni spinali nei topi SOD1-G93A.

L’anticorpo agonista MuSK estende la durata della vita dei topi SOD1-G93A

La denervazione del muscolo del diaframma è responsabile della paralisi respiratoria letale nei topi SOD1-G93A e nella SLA. Abbiamo quindi chiesto se il mantenimento delle sinapsi neuromuscolari e il miglioramento della produzione del muscolo del diaframma hanno prolungato la durata della vita dei topi SOD1-G93A. Femmina SOD1-G93A topi SOD1-G93A iniettati con l’anticorpo di controllo per GP120 aveva una durata media di 169 giorni (vedi Materiali e metodi), mentre i topi maschi SOD1-G93A iniettati con l’anticorpo di controllo aveva una durata media di 157,5 giorni (Figura 6C,D). L’iniezione cronica con l’anticorpo agonista MuSK ha prolungato la sopravvivenza dei topi SOD1-G93A femmina e maschio di 7 (p<0,05) e 10 giorni (p<0,001), rispettivamente (Figura 6C,D). Così, l’anticorpo agonista MuSK, introdotto dopo l’insorgenza della malattia, ha rallentato lo smontaggio delle sinapsi neuromuscolari, ha migliorato la potenza motoria del muscolo del diaframma e ha prolungato la durata della vita dei topi SOD1-G93A.

Discussione

La SLA è una malattia devastante che progredisce in modo inesorabile dal distacco dei terminali dei nervi motori alla paralisi respiratoria letale entro diversi anni dalla diagnosi. Attualmente, c’è un bisogno insoddisfatto di terapie che alterano significativamente il corso della malattia. Qui, descriviamo un approccio terapeutico progettato per rallentare la perdita dell’innervazione motoria al muscolo, mirando ad una molecola ben definita e ad un meccanismo per la formazione e il mantenimento delle sinapsi neuromuscolari. Mostriamo che un anticorpo agonista contro la MuSK, introdotto dopo l’insorgenza della malattia, diminuisce la denervazione muscolare, migliora la produzione del sistema motorio, riduce la perdita di motoneuroni e prolunga la sopravvivenza in un modello murino aggressivo di SLA. Se questa strategia, qui descritta per un modello murino aggressivo di SLA, avesse un successo simile nel preservare l’innervazione nella SLA sporadica e familiare, questo approccio terapeutico avrebbe il potenziale di migliorare la qualità della vita dei pazienti SLA, e come tale merita un ulteriore studio.

L’RNA anti-senso diretto verso la SOD1 è attualmente in fase di test come promettente terapeutico per la SLA causata da mutazioni nella SOD1 (Miller et al., 2013). Un approccio simile potrebbe in definitiva essere efficace per altre forme dominanti e familiari di SLA (Reddy e Miller, 2015; van Zundert e Brown, 2017). Tuttavia, a più dell’80% dei pazienti affetti da SLA viene diagnosticata una SLA sporadica, per cui le strategie per inattivare un singolo gene colpevole non sono sostenibili per la maggior parte dei casi di SLA. Invece, saranno probabilmente necessari interventi terapeutici multipli e simultanei che affrontino efficacemente la patologia e i sintomi della SLA per alterare il decorso della malattia (Brown e Al-Chalabi, 2017).

Poiché la perdita sinaptica e la denervazione muscolare sono comuni a forme sporadiche e familiari di SLA, l’approccio qui descritto ha il potenziale per essere efficace per entrambe le forme di SLA. Inoltre, l’aumento dell’attività MuSK e la segnalazione retrograda può anche rallentare il deterioramento delle sinapsi neuromuscolari in altre malattie neuromuscolari e durante l’invecchiamento (Engel et al., 2015; Gilhus e Verschuuren, 2015; Valdez et al., 2012; Poort et al., 2016). Coerentemente con questa idea, l’espressione adenovirale di Dok-7, un attivatore interno-esterno del MuSK, non solo estende la longevità dei topi SOD1-G93A, ma fornisce anche benefici in altri modelli murini di malattie neuromuscolari, tra cui la miastenia congenita e la distrofia muscolare Emery-Dreifuss (Miyoshi et al., 2017; Arimura et al., 2014). Inoltre, è sempre più evidente che la perdita sinaptica si verifica precocemente durante la progressione della malattia in altre malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Huntington, il morbo di Parkinson e la demenza frontotemporale e l’atrofia muscolare spinale (Henstridge et al., 2016), per cui strategie simili, progettate per preservare le sinapsi, possono rallentare la progressione anche in queste malattie.

I nostri esperimenti di proof of concept sono stati progettati per determinare se l’aumento della segnalazione retrograda in vivo con l’anticorpo agonista MuSK potrebbe rallentare il ritiro dell’assone motorio e la denervazione muscolare nei topi SOD1-G93A. Come tale, abbiamo introdotto l’anticorpo agonista MuSK dopo che la denervazione era già evidente, durante la fase iniziale della denervazione nei topi SOD1-G93A femmina e nella fase intermedia nei topi maschi SOD1-G93A, ma prima che i topi SOD1-G93A mostrassero evidenti e gravi deficit nella funzione motoria degli arti. Questa tempistica per la consegna dell’anticorpo agonista MuSK può essere pertinente e significativa per la SLA, in quanto la denervazione è la causa delle fibrillazioni muscolari, un segno clinico precoce nella SLA. Poiché la segnalazione retrograda dipendente dalla MuSK è probabile che agisca in modo focale sui terminali nervosi e sugli assoni che si trovano vicino alla membrana postsinaptica e che sia meno efficace nel promuovere la rigenerazione degli assoni che si sono completamente ritirati, la consegna precoce di un agonista MuSK è probabilmente più efficace rispetto alla consegna successiva nella SLA.

Tuttavia, la SLA è una diagnosi di esclusione, che porta a ritardi nella diagnosi. Tuttavia, anche negli stadi avanzati della malattia, la maggior parte delle sinapsi nei topi SOD1-G93A sono parzialmente innervate, e l’anticorpo agonista MuSK ha migliorato la copertura terminale del nervo in queste sinapsi parzialmente innervate. Questi risultati suggeriscono che l’anticorpo agonista MuSK può anche essere efficace se introdotto successivamente durante la malattia. Tuttavia, poiché i deficit motori evidenti diventano evidenti nei topi SOD1-G93A solo un mese prima della morte, questo modello di topo aggressivo di SLA può non essere il modello ottimale e più informativo per dedurre se l’introduzione successiva dell’anticorpo agonista MuSK può stabilizzare le sinapsi e le disfunzioni motorie lente nella SLA.

La perdita di motoneuroni durante lo sviluppo embrionale è regolata, almeno in parte, dalla formazione di sinapsi (Hollyday and Hamburger, 1976; Tanaka e Landmesser, 1986; Landmesser, 1992). L’aumento della sopravvivenza dei motoneuroni nei topi agonisti MuSK con anticorpi SOD1-G93A ad iniezione di SOD1-G93A indica che i motoneuroni adulti possono anche ricevere supporto trofico dal muscolo. Così, preservando le sinapsi neuromuscolari non solo mantiene l’attaccamento essenziale del nervo al muscolo, ma fornisce anche il beneficio aggiunto di promuovere la sopravvivenza dei motoneuroni.

Anche se abbiamo usato un anticorpo agonista al MuSK per stimolare la segnalazione retrograda dal muscolo, si possono prevedere altri approcci per stimolare il MuSK o migliorare la segnalazione retrograda al fine di mantenere l’attaccamento degli assoni motori al muscolo. L’anticorpo agonista MuSK è efficace nel mantenere le sinapsi neuromuscolari nei topi SOD1-G93A fino a P162, ma entro la prossima settimana le sinapsi si perdono e i topi muoiono. Poiché l’anticorpo agonista MuSK è progettato per mantenere le sinapsi neuromuscolari e non mira direttamente o affrontare la causa sottostante della malattia e di altre patologie nei topi SOD1-G93A e nella SLA, il beneficio di aumentare la segnalazione retrograda dal muscolo al nervo e di promuovere l’attaccamento terminale del nervo è limitato. Tuttavia, anche se l’anticorpo non può annullare le numerose vie patologiche che si verificano nel motoneurone e nelle cellule non neuronali, questo approccio terapeutico ha un potente effetto sul decorso della malattia, riducendo la perdita sinaptica, migliorando la potenza motoria e prolungando la durata della vita dei topi SOD1-G93A più a lungo del riluzolo, l’antico trattamento approvato dalla FDA per la SLA (Jablonski et al., 2014). La morte delle cellule motoneuronali è una caratteristica critica nella SLA, ma l’eliminazione del Bax, che previene la morte delle cellule apoptotiche, non riesce a preservare le sinapsi neuromuscolari e aumenta la sopravvivenza dei topi SOD1-G93A di soli 20 giorni (Gould et al., 2006). Insieme ai nostri studi, questi risultati danno credito all’idea che gli interventi terapeutici combinatoriali, compresi quelli che preservano le sinapsi neuromuscolari, saranno necessari per affrontare pienamente la complessa patologia e i sintomi della SLA e contribuire ad una migliore qualità di vita per il paziente e la famiglia.

Materiali e metodi

Tabella delle risorse chiave.
Tipo di reagente (specie) o risorsa	Designazione	Fonte o riferimento	Identificatori
sforzo, sforzo di fondo (topo)	Il topo: B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J	Il Laboratorio Jackson	RRID:IMSR_JAX:004435
deformazione, sfondo di deformazione (mouse)	Il topo: C57BL/6J	Il Laboratorio Jackson	RRID:IMSR_JAX000664
linea cellulare (mouse)	Mouse C2C12 cellule muscolari scheletriche del muscolo scheletrico	Laboratorio degli oneri	ATCC Cat# CRL-1772, RRID:CVCL_0188
linea cellulare (mouse)	Il topo: Cellule muscolari di tipo selvaggio immortalate	Laboratorio di carico	PMID: 18848351
linea cellulare (topo)	Il topo: Cellule muscolari mutanti Lrp4 immortalate	Laboratorio oneri	PMID: 18848351
anticorpo	Coniglio anti-Neurofilame-L	Sistemi sinaptici	Cat# 171 002, RRID:AB_887743
anticorpo	Coniglio anti-Synapsin 1/2	Sistemi sinaptici	Cat# 106 002, RRID:AB_887804
anticorpo	Alexa 647-anti-human IgG	Tecnologie per la vita	Cat# A-21445, RRID: AB_2535862
anticorpo	anti-colina acetiltrasferasi	Millipore	Cat# AB144P-200UL, RRID:AB_90661
anticorpo	anti-NeuNEuN	Millipore	Cat# MAB377, RRID: AB_2298772
anticorpo	Coniglio anti-MuSK	Laboratorio oneri	PMID: 10781064
anticorpo	Capra anti-MuSK	Sistemi R e D	Cat# AF3904, RRID:AB_2147242
anticorpo	Coniglio anti-Dok-7	Laboratorio oneri	PMID: 18848351
anticorpo	Antifosfotrosina per topi 4G10	Millipore
peptide, proteina ricombinante	Alexa 594-alfa-bungarotossina	Tecnologie per la vita	Cat#B13423
peptide, proteina ricombinante	Alexa 488-alfa-bungarotossina	Tecnologie per la vita	Cat#B13422
peptide, proteina ricombinante	Hoechst 33342	Thermo Fisher	Cat# 62249
peptide, proteina ricombinante	Proteina Agrin ricombinante di ratto	Sistemi R e D	Cat#550-AG-100
saggio commerciale o kit	GAPDH TaqMan Assay Mm00186822_cn	Thermo Fisher	Cat# 4400291
software, algoritmo	Prisma 7.0	http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/	RRID:SCR_002798
software, algoritmo	Software di analisi delle immagini 3D Volocity	http://www.perkinelmer.com/pages/020/cellularimaging/products/volocity.xhtml	RRID:SCR_002668
software, algoritmo	Suite di software pCLAMP	https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/pclamp-11-software-suite
altro	DietGel 76A	ClearH20	Cat#72-07-5022

Studio di progettazione

Gli investigatori non erano in grado di sapere se i topi erano stati trattati con l’agonista MuSK o con l’anticorpo di controllo durante l’acquisizione e l’analisi iniziale dei dati. I dati sono presentati come medi ±SEM. I confronti statistici tra i gruppi sono stati analizzati utilizzando un t-test dello studente non accoppiato e a due code, un test log-rank (sopravvivenza), una regressione lineare (CMAP), o un ANOVA a due vie (fallimenti). Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software Prism 7.0 (software GraphPad). Il numero (n) di topi utilizzati per calcolare la media, i valori SEM e i limiti di confidenza (valori p) sono indicati nelle legende delle figure.

Topi

Il numero di copie del gene SOD1-G93A umano è stato quantificato di routine dalla PCR in tempo reale TaqMan e normalizzato a GAPDH (Life Technologies Assay# Mm00186822_cn). Tutti i topi inclusi in questo studio avevano 21-26 copie di hSOD1-G93A (Figura 3-figure supplement 1). DietGel 76A (ClearH20) è stato posizionato sul pavimento della gabbia in modo che i topi avessero accesso al nutrimento. Altri hanno misurato la durata della vita dei topi SOD1-G93A mettendo i topi sul loro fianco e sacrificando i topi se non erano in grado di raddrizzarsi in 15 s. Poiché eravamo preoccupati che questo saggio riferito sulla funzione muscolare degli arti e non può essere temporalmente allineato con l’ora della morte, abbiamo usato un saggio variante, che ha fornito una misura accurata della longevità. Quando i topi non sono stati in grado di raddrizzarsi per mangiare o bere nel corso di diverse ore, hanno invariabilmente ceduto nel giro di un giorno; abbiamo definito questo tempo come punto finale della malattia e abbiamo sacrificato i topi in questo momento. I topi sono stati alloggiati e mantenuti secondo le linee guida dell’Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC).

Istologia

I muscoli del diaframma sono stati macchiati con α-bungarotossina coniugata con Alexa 594 (α-BGT) (Life Technologies, Carlsbad, CA) per marcare gli AChR e gli anticorpi di coniglio contro Neurofilament-L (SYnaptic Systems, Goettingen, Germania) e Synapsin 1/2 (SYynaptic Systems, Goettingen, Germania) per etichettare assoni e terminali nervosi, come descritto in precedenza (Jaworski e Burden, 2006; Friese et al., 2007). Alle sinapsi completamente innervate, la colorazione dei terminali nervosi si è completamente sovrapposta alle AChR postsinaptiche, mentre i terminali nervosi erano assenti dai siti sinaptici originali, contrassegnati dalle AChR, alle sinapsi completamente denervate. Alle sinapsi parzialmente innervate, i terminali nervosi occupavano solo una parte della membrana postsinaptica. Abbiamo esaminato un minimo di 50 sinapsi nel muscolo del diaframma di ogni topo e abbiamo designato ogni sinapsi come completamente innervate, parzialmente innervate o completamente denervate. Ad ogni sinapsi parzialmente innervata, la percentuale di membrana postsinaptica macchiata di AChR che è stata applicata da terminali nervosi macchiati di sinapsi è stata quantificata utilizzando il software di imaging Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA). Per visualizzare e quantificare la colorazione dell’anticorpo agonista, contenente Fc umano, alla giunzione neuromuscolare, abbiamo usato un secondario antiumano coniugato con Alexa 647 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Interi montaggi di muscoli sono stati ripresi con un microscopio confocale Zeiss LSM800, e il segnale fluorescente è stato quantificato come descritto in precedenza (Jaworski and Burden, 2006; Friese et al., 2007).

I cordoni spinali sono stati sezionati da topi perfetti con il 4% di formaldeide. Sezioni congelate (20 μm) della regione lombare sono stati macchiati con anticorpi contro l’acetiltrasferasi colina (ChAT) (AB144P-200UL da Millipore, Billerica, MA). Abbiamo definito i motoneuroni come cellule nel corno ventrale del midollo spinale lombare che erano positivi per la ChAT, escludendo i neuroni pregangliari ChAT-positivi e Pitx2-positivi. Abbiamo contato solo le cellule macchiate di ChAT con un nucleo chiaramente definito, al fine di evitare il doppio conteggio dei motoneuroni in sezioni multiple. Abbiamo analizzato ~10 sezioni, uniformemente distanziate nell’ingrandimento lombare, che insieme contenevano >50 motoneuroni in ogni topo.

Legame anticorpale e fosforilazione MuSK

Gli anticorpi chimerici sono stati prodotti trasferendo i cDNA che codificano le regioni variabili dell’anticorpo agonista MuSK #13 ai vettori di espressione che contengono la regione costante kappa e IgG2a del mouse. Gli anticorpi agonisti MuSK sono stati prodotti in cellule CHO e purificati con la proteina A e la cromatografia ad esclusione della dimensione. L’attività dell’anticorpo chimera inversa per la stimolazione del clustering di AChRs in miotoubi C2 era simile a quella dell’anticorpo agonista umano per MuSK (Figura 4-figure supplement 1). Frammenti Fab sono stati preparati da digestione proteasi di IgG1 umana IgG1 seguito dalla rimozione di frammenti di IgG e Fc non salvati su una colonna di Proteina A Sepharose e cromatografia esclusione dimensioni.

Abbiamo usato un test di legame in fase solida per misurare il legame tra l’anticorpo agonista MuSK e la regione extracellulare (ecto) (da E22 a T494), i primi tre domini Ig-like (da E22 a I103) o il dominio Frizzled-like (da D312 a K456) del mouse MuSK (Zhang et al., 2011). Maxisorp piastre sono state rivestite con anticorpo agonista MuSK # 13 (5μg/ml), e successivamente incubato con 8-His-tagliato MuSK proteine, seguito da un anticorpo coniugato perossidasi di rafano (HRP) coniugato con 8-His. L’HRP legato è stato quantificato misurando l’attività dell’HRP (Thermo scientific#34028).

C2C12 cellule muscolari sono stati acquistati presso l’ATCC e non sono stati testati per micoplasma prima dell’uso. Queste cellule muscolari C2C12, così come immortalato tipo selvaggio o Lrp4 cellule muscolari mutanti Lrp4, sono stati differenziati e trattati con Agrin neurale (1 nM) o anticorpi (10 nM). MuSK è stato immunoprecipitato da lisati, e l’espressione MuSK e la fosforilazione tirosina MuSK sono stati misurati sondando macchie occidentali, come descritto in precedenza (Herbst e Burden, 2000). Le cellule C2C12 sono state coltivate in piastre di coltura a 24 pozzetti in DMEM con il 10% di siero bovino fetale (FBS) fino a quando i mioblasti erano il 70% confluenti. I mioblasti sono stati poi permesso di differenziare in miotubi sostituendo il FBS con il 2% di siero di cavallo. Dopo 7 giorni, le colture sono state trattate per 16 ore con concentrazioni variabili di anticorpo rcMuSK # 13 o un Fab dall’anticorpo MuSK # 13. Le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 4% e colorate con Alexa 488 coniugato – α-BGT. Da ogni pozzetto sono state raccolte da due a quattro immagini e il numero di cluster AChR è stato analizzato con il software imageJ. Neural Agrin (10 nM) (R e D Systems, Minneapolis, MN) è stato utilizzato come controllo positivo per il clustering AChR (dati non mostrati).

I muscoli degli arti posteriori sono stati denervati tagliando il nervo sciatico, come descritto in precedenza (Simon et al., 1992). Quattro giorni dopo la denervazione, i topi sono stati iniettati con l’anticorpo agonista MuSK # 13, e abbiamo misurato l’espressione MuSK e la fosforilazione tirosina MuSK 3 giorni dopo. MuSK e Dok-7 sono stati immunoprecipitati dai lisati, e i loro livelli di espressione sono stati determinati da Western blotting (Herbst and Burden, 2000; Hallock et al., 2010). La fosforilazione della tirosina MuSK è stata misurata sondando Western blotting con l’anticorpo 4G10, come descritto in precedenza (Herbst and Burden, 2000; Hallock et al., 2010).

Registrazione e valutazione dei potenziali d’azione dei muscoli composti (CMAP) dal muscolo del diaframma

Per valutare la funzione della giunzione neuromuscolare nel muscolo del diaframma del topo (Figura 5-figure supplement 1), abbiamo sviluppato una preparazione ex vivo del nervo frenico-diaframma. Abbiamo studiato il muscolo del diaframma da ~ P140 maschi e ~ P150 topi femmina, che è di tre o quattro settimane prima della fase finale, rispettivamente. Non abbiamo utilizzato la preparazione in vivo, descritto da altri (Lepore et al., 2011), perché temevamo che la stimolazione in vivo del nervo frenico, a frequenze da moderate ad alte, avrebbe portato a registrazioni CMAP variabili e inaffidabili, probabilmente a causa di cambiamenti nella posizione degli elettrodi causati dalla contrazione muscolare. Inoltre, un metodo correlato, riportato per registrare dal muscolo del diaframma del topo, utilizza un elettrodo di registrazione di superficie, e probabilmente controlla l’attività di più muscoli toracici (Martin et al., 2015). Così, a seguito di anestesia con il 5% di isoflurano, i topi sono stati decapitati, e il muscolo del diaframma, insieme al nervo frenico, è stato rapidamente isolato e trasferito in una camera di registrazione personalizzata. La camera è stato perfuso continuamente con ossigenato (95% O2 e 5% di_CO2) soluzione artificiale liquido cerebrospinale (128,25 mM NaCl, 4 mM KCl, 0,58 mM NaH2PO4, 21 mM NaHCO3, 30 mM D-glucosio, 1,5 mM CaCl2, e 1 mM MgSO4) ad una velocità di ~ 10 ml / min a temperatura ambiente (~ 20-24 ° C). Il nervo frenico che innerva il muscolo emi-diaframma sinistro è stato stimolato disegnando la parte distale del nervo frenico sinistro in un elettrodo di aspirazione (Figura 5-figure supplemento 1). Abbiamo convalidato il corretto posizionamento dell’elettrodo stimolante ispezionando visivamente le contrazioni muscolari dopo la stimolazione del nervo frenico. L’attività EMG è stata registrata utilizzando un elettrodo di aspirazione posto nel quadrante superiore sinistro del muscolo, 1 mm verso il lato costale del nervo intramuscolare principale e la zona della piastra terminale al centro del muscolo. Una leggera aspirazione è stata applicata all’elettrodo di registrazione per assicurare una tenuta ermetica tra la punta dell’elettrodo e le fibre muscolari. In questo modo, il danno al muscolo del diaframma è stato evitato, il che è stato confermato osservando le contrazioni muscolari durante la stimolazione. Il nervo frenico è stato stimolato con impulsi quadrati (0,2 ms di durata) a diverse frequenze (da 1 Hz a 50 Hz) per 60 s. L’intensità della stimolazione è stata progressivamente aumentata dalla soglia, definita come la risposta minima in tre prove su cinque, fino a quando il CMAP ha raggiunto una risposta massima.

L’intensità di stimolazione è stata impostata al doppio dell’intensità richiesta per la risposta massima per garantire un’intensità di stimolazione sovramassimale (da 25µA a 200µA). Le registrazioni sono state accettate per l’analisi solo quando l’ampiezza CMAP (picco-picco) è rimasto invariato dopo 1 Hz stimolazione. Le ampiezze dei CMAP evocati a frequenze più elevate sono stati espressi come percentuale del primo CMAP evocato per tutta la durata della stimolazione. Le registrazioni sono state alimentate ad un’interfaccia A / D (Digidata 1440A, Dispositivi Molecolari) e acquisite con Clampex (v10.2, Dispositivi Molecolari) ad una frequenza di campionamento di 50 kHz. I dati sono stati analizzati off-line utilizzando Clampfit (v10.2, Dispositivi Molecolari). Abbiamo definito i guasti CMAP come l’assenza di una risposta evocata distinguibile dal rumore di fondo registrato prima della stimolazione.

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