Le fibre da stress muscolo-specifiche danno origine a sarcomeri nei cardiomiociti

Introduzione

Al suo interno, un sarcomero è composto da filamenti di miosina II “spessi” e da filamenti di actina “sottili” (Figura 1A) (Au,2004). Un sarcomero è misurato da linea Z a linea Z, che contengono α-acttinina 2 (Figura 1A). La corretta costituzione dei sarcomeri cardiaci durante lo sviluppo e la loro successiva manutenzione è fondamentale per la funzione cardiaca. Precedenti studi sui miociti in coltura hanno dimostrato la presenza di fasci di actina chiamati ‘strutture simili a fibre da stress’ simili in apparenza alle classiche fibre da stress (Dlugoszet al., 1984). Queste fibre da stress sono state spesso trovate vicino al bordo del miocita con sarcomeri esistenti più lontano dal bordo(Rhee et al., 1994). Questi studi hanno proposto che le fibre da stress servissero da modello per la formazione di sarcomeri(Dlugosz et al., 1984; Rhee et al., 1994; Sanger et al., 2005). Il modello originale che lo propose si chiamava Templating Model(Dlugosz et al., 1984), e fu proposto prima che si sapesse che queste fibre da stress contenevano sia proteine non muscolari che sarcomeriche(Rhee et al., 1994). Oltre alla miosina non muscolare IIB (NMIIB), presente nelle cellule non muscolari, le fibre da stress nelle cellule muscolari contengono proteine specifiche del muscolo, come α-actinina, tropomiosina, troponine e tropomodulina (Almenar-Queralt et al.,1999; Rhee et al., 1994; Sanger et al., 2005). Ognuna di queste proteine ha paraloghi non muscolari, che probabilmente svolgono funzioni simili(Bryce et al., 2003; Colpan et al., 2013; Côté, 1983; Gunning et al., 2015; Lim et al., 1986; Sjöblom et al., 2008). In parte in risposta alla presenza di proteine specifiche del muscolo nelle fibre da sforzo, il Modello di Templating è stato modificato al “Modello Pre-Myofibril” (Rhee et al.,1994; Sanger et al., 2005). Anche se questi modelli hanno nomi diversi e sono spesso presentati come reciprocamente esclusivi, sono molto simili nelle loro previsioni. In particolare, entrambi i modelli pongono un fascio di actina che appare strutturalmente simile ad una fibra da stress acquisirà nel tempo una fila di sarcomeri per diventare una ‘miofibrilla’ (Dlugoszet al., 1984; Rhee et al. , 1994; Sanger et al., 2005) (Figura 1A). C’è una grande quantità di dati di localizzazione in cardiomiociti fissi per supportare questi modelli. Tuttavia, ci sono pochissimi dati dinamici nelle cellule vive che suggeriscono che le fibre da stress danno origine a sarcomeri. Il supporto dinamico più forte proviene da imaging fluorescente taggato α-actinina 2 nei miociti. I montaggi temporali dei miotobuli scheletrici dei pulcini hanno mostrato piccoli puncta di α-actinina 2 che si aggiungono alle linee Z preesistenti (McKennaet al., 1986). Successivamente, un montaggio temporale è stato utilizzato per mostrare un fenomeno simile che si verifica nei cardiomiociti dei pulcini(Dabiri et al., 1997).

Alcuni dati in vivo supportano il modello Template/Pre-Myofibril, mentre altri non lo fanno. A forte sostegno del modello Template/Pre-Myofibril, le immagini statiche del tessuto cardiaco dei pulcini hanno essenzialmente rivelato ogni struttura descritta nei cardiomiociti primari dei pulcini in coltura(Du et al., 2008). La presenza di fibre da stress contenenti NMIIB nei cardiomiociti era particolarmente chiara(Du et al., 2008). Anche i topi NMIIB a eliminazione dei germi (KO) sono stati segnalati per avere un minor numero di sarcomeri disorganizzati via EM(Tullio et al., 1997). D’altra parte, diversi studi hanno messo in discussione il ruolo delle fibre di stress nell’assemblaggio dei sarcomeri. In primo luogo, diversi studi che esaminano i cardiomiociti all’interno del tessuto cardiaco di topo o di pulcino non hanno trovato fibre da stress contenenti NMIIB(Ehler et al., 1999; Kan-O et al., 2012; Ma et al., 2009). Inoltre, un topo KO condizionato che rimuove geneticamente l’NMIIB a P9 apparentemente aveva ancora strutture di sarcomeri striati(Ma et al., 2009). Infine, un KO condizionato del cuore dell’altro paralogio principale del NMII, il NMIIA, è stato anche segnalato come non abbia difetti apparenti nella formazione del cuore(Conti et al., 2004; Conti et al., 2015). Nel complesso, la mancanza di dati chiari che mostrino le fibre da stress nei cardiomiociti e le incongruenze per un ruolo della NMII nell’assemblaggio dei sarcomeri mette in dubbio se il Modello Modello Pre-Miofibrilla sia un costrutto valido per la comprensione dell’assemblaggio dei sarcomeri(Sanger et al., 2005; Sparrow e Schöck, 2009).

Ci sono ulteriori dati che suggeriscono che un meccanismo diverso da quello descritto nel modello Template/Pre-Myofibril potrebbe guidare l’assemblaggio dei sarcomeri. Questo modello alternativo chiamato “Modello di cucitura” si basa sull’idea che le parti di un sarcomero siano assemblate indipendentemente e poi riunite (cioè cucite) (Holtzer et al.,1997; Lu et al., 1992; Sanger et al., 2005). A sostegno del modello di cucitura, gli studi di Drosophila hanno dimostrato la presenza di piccoli filamenti di miosina dopo l’abbattimento (KD) di componenti separati della linea Z(Rui et al., 2010). Questi dati suggeriscono che i filamenti di miosina possono essere assemblati indipendentemente dalle linee Z. Infatti, ci sono anche micrografie elettroniche che sembrano mostrare pile di filamenti di miosina II (cioè, bande A) senza filamenti di actina rilevabili nel muscolo scheletrico(Holtzer et al., 1997; Lu et al., 1992; Sanger et al., 2005). L’esame di micrografie elettroniche supporta anche l’idea che corpi contenenti componenti della linea Z e filamenti di actina chiamati ‘I-Z-I’ possano esistere anche nel muscolo scheletrico senza filamenti di miosina II apparente (Holtzer et al.,1997; Lu et al., 1992; Sanger et al., 2005). Sulla base di questi dati, è stato proposto che la cucitura possa avvenire attraverso l’assemblaggio sequenziale aggiungendo nuovi corpi I-Z-I e filamenti di miosina II(Holtzer et al., 1997; Lu et al., 1992; Sanger et al., 2005).

Il Modello Modello di Template/Pre-Myofibril e il Modello di cucitura sono stati proposti come spiegazioni reciprocamente esclusive di come nascono i sarcomeri. Il Modello Modello Modello Pre-Miofibrilla prevede che più sarcomeri appariranno approssimativamente simultaneamente lungo la lunghezza di una fibra di tensione, mentre il Modello Stitching prevede che i sarcomeri appariranno adiacenti uno ad uno, in sequenza (vedi modelli originali in(Dlugosz et al., 1984; Holtzer et al., 1997; Rhee et al., 1994)). Qui, facciamo leva sulla nostra scoperta che i cardiomiociti pluripotenti indotti dall’uomo immaturo, derivati da cellule staminali pluripotenti (hiCM), indotti dall’uomo, si smontano completamente e poi rimontano i loro sarcomeri dopo la placcatura per testare queste possibilità. Utilizzando questo test, dimostriamo che i sarcomeri sono assemblati direttamente da modelli di fibre di actina da stress, e ci riferiamo a queste fibre da stress come Muscle Stress Fibers (MSFs). I nostri dati suggeriscono che l’assemblaggio dei sarcomeri dipende dal nucleatore del filamento di actina formina, FHOD3, dalla miosina non muscolare IIA e dalla miosina non muscolare IIB. Sorprendentemente, i nostri dati non supportano completamente né il Modello Modello di Template/Pre-Myofibril né il Modello di cucitura, ma piuttosto alcuni aspetti di ciascuno di essi. Come tale, proponiamo ora un modello unificato di assemblaggio dei sarcomeri basato sulla formazione di MSF e sulla loro successiva transizione in miofibrille contenenti sarcomeri.

Risultati

Sviluppo di un saggio per testare l’assemblaggio del sarcomero

Per affrontare le modalità di assemblaggio dei sarcomeri cardiaci, abbiamo utilizzato gli hiCM come sistema modello (vedi Materiali e metodi)(Takahashi et al., 2007). Abbiamo notato per la prima volta i filamenti di actina negli hiCMs, che si erano diffusi per 24 ore, avevano due organizzazioni distinte, le fibre di stress muscolare (MSF) e le miofibrille contenenti sarcomeri(Figura 1B). Diffondere hiCMs visualizzato MSFs al bordo anteriore e organizzato strutture sarcomeriche nel corpo cellulare(Figura 1B). Sorprendentemente, super-risoluzione di imaging ha rivelato la MSF in hiCMs assomigliava a una classica fibra di actina stress trovato in cellule non muscolari, indicato come archi di actina(Figura 1C e D)(Heath, 1983; Hotulainen e Lappalainen, 2006). Gli archi di actina sono fibre di stress sulla superficie dorsale (in alto) della cellula che sono parallele al bordo di entrata e si colorano continuamente con falloidina fluorescente(Figura 1C). Allo stesso modo, sia MSF e sarcomeri in hiCM sono sulla superficie dorsale(Figura 1B). Abbiamo poi cercato di testare il concetto che un MSF ottenuto sarcomeri come previsto dal modello Templating/Pre-Myofibril.

Per verificare se le MSF danno origine a sarcomeri, abbiamo dovuto sviluppare un test di assemblaggio dei sarcomeri. Abbiamo notato che hiCMs che era stato appena placcato (1,5-4 hr post placcatura) non conteneva sarcomeri sia al bordo della cellula o del corpo cellulare, come visualizzato da SIM (Figura 1-figure supplemento 1A). La perdita della struttura del sarcomero è stata confermata dalla visualizzazione di più proteine sarcomeriche, tra cui actina, beta miosina cardiaca II (βCMII), α-acttinina 2, e TroponinT (Figura 1-figuresupplement 1A). Anche se hiCMs non conteneva sarcomeri ai primi punti di tempo post placcatura, hiCMs ha fatto visualizzare MSFs al bordo della cella(Figura 1-figure supplemento 1A). hiCMs successivamente assemblato strutture sarcomeri nel corso di 24 ore (Figura 1-figure supplemento 1B). Abbiamo poi cercato di testare se MSFs template sarcomeri. Infatti, microscopia time-lapse di hiCMs che esprimono la sonda di actina Lifeact-mEmerald(Riedl et al., 2008) ha rivelato che MSFs acquisire sarcomeri nel tempo, con i primi sarcomeri che appaiono tra 4 e 16 ore(Figura 1E e F e Video 1). Non sorprende che questa transizione avvenga sulla superficie dorsale della cellula(Figura 1G). È importante notare che, per visualizzare l’assemblaggio dei sarcomeri in hiCMs dal vivo, abbiamo iniziato la nostra immagine nei primi punti di tempo post placcatura (cioè, 1,5-4 ore). In questi punti di tempo, hiCMs non contengono sarcomeri(Figura 1-figure supplemento 1A), e questo ci ha assicurato che stavamo visualizzando l’evento iniziale di assemblaggio sarcomero, e non sarcomeri riorganizzazione o riorganizzazione.

Per caratterizzare ulteriormente il nostro test di assemblaggio dei sarcomeri, abbiamo usato α-actinina 2, che è un classico marcatore di linee Z (Lutero, 2009). Endogena α-actinina 2 localizzata sia a MSF che a sarcomeri (Figura 2A). Piccoli punti di α-actinina 2 localizzati a MSF, mentre i sarcomeri avevano α-actinina 2 lineare che etichettava le linee Z (Figura 2A). Come è stato mostrato in altri sistemi(Dabiri et al., 1997; Du et al., 2008), la spaziatura tra α-acttinina 2 puncta aumenta durante la transizione da MSF a sarcomero, con la spaziatura di α-acttinina 2 ~ 0,5 µm in MSF e ~1,7 µm in sarcomeri (Figura 2B). In hiCMs, α-actinina 2 puncta in MSF si alterna con NMII, come è stato mostrato per altri sistemi (Figura 2-figure supplement 1) (Ehler etal., 1999; Hotulainen e Lappalainen, 2006; Rhee et al., 1994; Sanger et al., 2005). È interessante notare che la spaziatura di α-acttinina 2 puncta associata a MSF in hiCM era molto simile alla spaziatura di α-acttinina 4 (cioè, un paralogico non muscolare di α-acttinina) in archi di actina nelle cellule U2OS (Figura 2C). Se le MSF servivano come modello per i sarcomeri, abbiamo chiesto se le molecole di α-actinina 2 nelle MSF erano anche incorporate nelle strutture dei sarcomeri. I dati precedenti suggeriscono che α-actinina 2 puncta si uniscono alle linee Z esistenti (Dabiri etal., 1997; McKenna et al., 1986). Per testare questa ipotesi, abbiamo utilizzato una sonda fotoconvertibile, tdEOS, che converte la fluorescenza dal verde al rosso per marcare specificamente la α-actinina 2 puncta delle MSF (Nienhauset al., 2006; Wiedenmann et al., 2004). Abbiamo trovato che un sottoinsieme di fotoconvertito α-acttinina 2-tdEOS puncta sono stati effettivamente incorporati in linee Z (Figura 2D). Collettivamente, questi risultati suggeriscono fortemente che le MSF danno origine a sarcomeri in hiCM.

Actina flusso retrogrado in hiCMs e cellule non muscolari

Abbiamo poi voluto indagare ulteriormente sulle somiglianze tra MSF e archi di actina. Le fibre di stress da arco di actina nelle cellule non muscolari subiscono un robusto ‘flusso retrogrado’ lontano dal bordo della cellula, come si può vedere nelle cellule U2OS, un classico modello di migrazione mesenchimale (Figura 3Ae C) (Hotulainen e Lappalainen, 2006; Ponti et al., 2004). Le misurazioni chimografiche hanno rilevato che gli archi di actina nelle cellule U2OS si sono spostati a ~200 nm/min, in accordo con i risultati precedentemente pubblicati (Figura 3A e C)(Pontiet al., 2004). Abbiamo trovato MSFs anche sottoposti a flusso retrogrado(Figura 3B e C). Sorprendentemente, tuttavia, la chimografia ha rivelato MSF in hiCMs spostato significativamente più lento di archi di actina in cellule U2OS(Figura 3C). Questa è stata la prima indicazione che gli archi di actina in cellule non muscolari sono diversi da MSF in hiCMs. Abbiamo poi voluto definire i meccanismi che regolano le MSF e la loro acquisizione di sarcomeri. Poiché i meccanismi di formazione e mantenimento dell’arco di actina sono stati ben studiati(Burnette et al., 2014; Hotulainen e Lappalainen, 2006; Murugesan et al., 2016), eravamo interessati ad usare il nostro saggio per verificare se gli stessi meccanismi che guidano la dinamica dell’arco di actina stavano governando la dinamica dei MSF.

Formine, ma non il complesso Arp2/3, sono necessari per la formazione di sarcomeri basati su MSF

Il complesso Arp2/3 è ben noto per essere richiesto per la formazione di archi di actina in cellule non muscolari(Hotulainen e Lappalainen, 2006). Per testare il ruolo del complesso Arp2/3 durante l’assemblaggio dei sarcomeri, abbiamo permesso ad hiCMs di diffondersi in presenza di CK666, un inibitore del complesso Arp2/3(Nolen et al., 2009). Sorprendentemente, hiCMs permesso di diffondere in presenza di CK666 formato MSFs robusto e sarcomeri comparabili a cellule di controllo non trattati(Figura 4A, inset, e 4B). Le cellule sono state quantificate come contenenti sarcomeri se contenevano tre linee Z parallele in fila, ciascuna separata dalla linea Z adiacente di 1 µm – 2,5 µm. Una localizzazione α-actinina 2 era definita come una linea Z se era almeno 2 volte la lunghezza del limite di risoluzione del microscopio (vedi Materiali e metodi). Inoltre, la spaziatura tra le linee Z tra controllo e CK666 hiCMs era invariata(Figura 4C). Abbiamo anche trovato il flusso retrogrado di MSF è rimasto invariato tra il controllo e CK666 hiCMs trattati(Figura 4D ed E). Per confermare l’inibizione del complesso Arp2/3 da CK666, abbiamo esaminato la localizzazione endogena del complesso Arp2/3 con e senza trattamento CK666. La localizzazione forte del complesso Arp2/3 al bordo del controllo hiCMs era assente in CK666 hiCMs trattati(Figura 4F e G). Per confermare ulteriormente questa osservazione, abbiamo analizzato la perdita di p16b, una sottounità del complesso Arp2/3, dal bordo anteriore del hiCMs via CK666 in hiCMs vivo. Infatti, hiCMs ha mostrato una rapida perdita di p16b-mEGFP dal bordo di testa a seguito della somministrazione di CK666(Figura 4H e I). La delocalizzazione del complesso Arp2/3 dal bordo anteriore è coerente con l’inattivazione da CK666, come mostrato in precedenza in cellule non muscolari(Henson et al., 2015). Presi insieme, i nostri dati suggeriscono che il complesso Arp2/3 non ha bisogno di essere localizzato al bordo d’attacco per i sarcomeri da assemblare.

Oltre al complesso Arp2/3, la polimerizzazione dell’actina mediata dalla formina ha dimostrato di essere cruciale per la formazione di archi di actina e la dinamica in più tipi di cellule(Hotulainen e Lappalainen, 2006; Murugesan et al., 2016). Come punto di partenza per verificare se le formine sono necessarie per l’assemblaggio dei sarcomeri, abbiamo permesso ad hiCMs di diffondersi in presenza di un pan-inibitore della polimerizzazione dell’actina mediata dalla formina, piccolo inibitore molecolare dell’omologia della formina dominio 2, SMIFH2(Rizvi et al., 2009). SMIFH2 ha dimostrato di arrestare la polimerizzazione dell’actina mediata dalla formina, la formazione di archi di actina e il flusso retrogrado nelle cellule non muscolari(Henson et al., 2015; Murugesan et al., 2016; Rizvi et al., 2009). Abbiamo trovato hiCMs diffusione in presenza di SMIFH2 completamente non è riuscito a formare sarcomeri(Figura 5A e B, e Figura 5-figure supplemento 1). Questo effetto era reversibile, in quanto i sarcomeri si sono formati dopo la rimozione di SMIFH2(Figura 5-figure supplement 2). Distanze tra le strutture di α-acttinina 2 sono state anche significativamente diminuite in hiCM trattati con SMIFH2, con la distribuzione di α-acttinina 2 più simile a MSF rispetto ai sarcomeri (Figure 5Ce 2C). Tuttavia, gli allineamenti della α-actinina 2 puncta non erano simili alle MSF nelle hiCM di controllo, in quanto non erano periodici (Figure5A e 2A). Questo risultato ha fortemente suggerito che le formine sono necessarie per il montaggio del sarcomero.

Abbiamo poi chiesto se l’inibizione della formina stesse colpendo direttamente le MSF o i sarcomeri. Per testare questo, abbiamo permesso ad hiCMs di diffondersi per 24 ore (dopo che hanno stabilito sarcomeri) e imaged loro citoscheletro actina tramite microscopia a cellule vive prima e dopo la somministrazione di SMIFH2(Figura 5D). Dopo l’aggiunta di SMIFH2, la formazione di nuove MSF è stata immediatamente bloccata, insieme al flusso retrogrado delle MSF esistenti(Figura 5D-5F). Tuttavia, non abbiamo rilevato alcun cambiamento nella struttura del sarcomero nel breve periodo di tempo dell’esperimento, e gli hiCM hanno continuato a battere in presenza di SMIFH2 (si noti la struttura del sarcomero nella Figura 5D). Poiché ci sono 15 geni di formina di mammifero, abbiamo poi chiesto quale formina specifica era richiesta per l’assemblaggio del sarcomero.

Abbiamo eseguito l’analisi di sequenziamento RNA di mRNA isolato da hiCMs. Conta lettura normalizzata ha rivelato che una formina, FHOD3, è stato espresso superiore a tutte le altre formine(Figura 6A). Infatti, i dati precedenti da cardiomiociti di ratto isolati hanno mostrato FHOD3 come cruciale per la manutenzione del sarcomero(Iskratsch et al., 2010; Kan-O et al., 2012; Taniguchi et al., 2009). I cardiomiociti di ratto contenenti miofibrille hanno successivamente perso le loro miofibrille in seguito all’abbattimento dell’FHOD3(Iskratsch et al., 2010; Taniguchi et al., 2009). Tuttavia, il ruolo dell’FHOD3 durante l’assemblaggio del sarcomero de novo non è stato testato. Pertanto, abbiamo cercato di utilizzare il nostro test per verificare direttamente se il modulo FHOD3 era necessario per l’assemblaggio dei sarcomeri basato su MSF. Abbiamo abbattuto FHOD3 utilizzando siRNA, e gli hiCM non sono stati in grado di assemblare i sarcomeri dopo la placcatura(Figura 6B e C). È interessante notare che KD delle due formine più altamente espresse dopo FHOD3, DAAM1 e DIAPH1, non ha fermato il montaggio dei sarcomeri(Figura 6C e Figura 6-figure supplement 1). Tuttavia, ci sono evidenti difetti nell’organizzazione dell’actina al bordo della cellula e nei sarcomeri(Figura 6-figure supplement 1). Poiché FHOD3 aveva il fenotipo più prominente, abbiamo deciso di concentrare la nostra ulteriore analisi su questa condizione. In linea con l’inibizione pan-formin, l’organizzazione dell’actina e la spaziatura tra α-acttinina 2 in FHOD3 KD hiCMs molto simile hiCMs diffusa in presenza di SMIFH2 (Figura 5A-5C e Figura 6B-6D ).

Sulla base dei nostri risultati, se FHOD3 è coinvolto nel montaggio di sarcomeri, dovrebbe localizzare a MSF. FHOD3-mEGFP localizzato a entrambi i MSF al bordo di hiCMs, e poi diventa sempre più organizzato lontano dal bordo di testa della cella in cui si trovano i sarcomeri(Figura 6E). Questa localizzazione è coerente con un ruolo per FHOD3 nel mediare la transizione da MSF a sarcomeri. Presi insieme, i nostri dati mostrano che la formin FHOD3 si localizza sia a MSF che a sarcomeri, ed è necessaria per l’assemblaggio de novo dei sarcomeri. Abbiamo poi voluto indagare su altri potenziali meccanismi che regolano l’assemblaggio dei sarcomeri.

Non miosina muscolare II è richiesto per i filamenti di actina del sarcomero cardiaco

Oltre ai nucleatori di actina, l’attività della miosinanon muscolare II (NMII) si è dimostrata necessaria per la formazione di archi di actina e l’organizzazione in tipi di cellule non muscolari(Hotulainen e Lappalainen, 2006; Medeiros et al., 2006). Così, abbiamo chiesto se l’NMII era necessaria per la formazione di MSF e/o la transizione di MSF al sarcomero. Per prima cosa abbiamo localizzato i due principali paraloghi di NMII negli esseri umani, NMIIA e NMIIB, in hiCM di diffusione(Vicente-Manzanares et al., 2009). Sia l’NMIIA che l’NMIIB si localizzano in archi di actina in cellule non muscolari(Kolega, 1998). Coerentemente con questo, sia NMIIA e NMIIB localizzati in MSF, e sono stati limitati dal centro della cella in cui sono stati localizzati i sarcomeri(Figura 7A e B). Infatti, la microscopia time-lapse ha rivelato filamenti NMIIA formato al bordo di hiCMs e sono stati sottoposti a flusso retrogrado come nelle cellule non-muscolari(Figura 7C). Tuttavia, NMIIA è rimasto al bordo di hiCMs ed è stato limitato dal corpo cellulare dove si formano i sarcomeri(Figura 7C e Video 2). NMIIB anche rimasto al bordo di hiCMs ed è stato limitato dal corpo cellulare in cui si formano i sarcomeri(Video 3). La stragrande maggioranza dei filamenti NMIIA e NMIIB si sono sovrapposti, tranne che sul bordo di testa, dove NMIIA è localizzato leggermente più avanti di NMIIB nelle hiCM(Figura 7A e B). La microscopia a super-risoluzione ha rivelato che la maggior parte dei filamenti NMIIA conteneva NMIIA e NMIIB(Figura 7D). NMIIA e NMIIB co-filamenti sono stati precedentemente riportati in cellule non muscolari(Beach et al., 2014; Shutova et al., 2014). Le misurazioni delle lunghezze dei co-filamenti NMII in hiCM hanno mostrato lunghezze in accordo con le misurazioni precedentemente pubblicate in cellule non muscolari(Figura 7D ed E)(Beach et al., 2014; Shutova et al., 2014). Presi insieme, questi dati suggeriscono l’organizzazione e la dinamica NMII appaiono simili in MSF di hiCMs come in archi di actina di cellule non-muscolari.

Data la presenza di NMIIA e NMIIB in ogni filamento all’interno di MSF, abbiamo poi chiesto se NMIIA e/o NMIIB erano necessari per l’assemblaggio dei sarcomeri. NMIIA è stato precedentemente dimostrato di essere richiesto per l’assemblaggio dell’arco di actina in cellule non muscolari(Figura 8-figure supplement 1) (Burnetteet al., 2014; Fenix et al., 2016). Così, abbiamo ipotizzato che NMIIA sarebbe probabilmente la chiave paralogica richiesta per la formazione di MSF e il successivo assemblaggio del sarcomero. Sorprendentemente, KD di NMIIA non ha portato ad una completa inibizione di MSF o di assemblaggio di sarcomeri, anche se i sarcomeri in NMIIA KD hiCMs erano disorganizzati(Figura 8A-8E e Figura 8-figure supplementi 2 e 3). In particolare, gli hiCM NMIIA KD hanno mostrato una distribuzione simile delle distanze tra le strutture α-actinina 2 rispetto agli hiCM di controllo (Figura 8D). Questa misurazione mostra che, sebbene ci siano meno e più sarcomeri disorganizzati nel NMIIA KD, le loro larghezze misurate da linea Z a linea Z sono simili agli hiCM di controllo. Tuttavia, le cellule NMIIA KD aveva significativamente più breve Z-linee rispetto al controllo hiCMs(Figura 8E). Presi insieme, questi dati suggeriscono che NMIIA è coinvolto nel montaggio sarcomero e l’organizzazione.

E ‘stato precedentemente mostrato NMIIB non è necessario per la formazione di archi di actina in cellule non muscolari(Kuragano et al., 2018; Shutova et al., 2017)(Figura 8-figure supplemento 1). Abbiamo ipotizzato che NMIIB non sarebbe necessario per MSF o assemblaggio di sarcomeri in hiCM. Sorprendentemente, NMIIB KD ha portato ad una completa incapacità di hiCMs di formare sarcomeri dopo la placcatura(Figura 8A-8D e Figura 8-figure supplementi 2 e 4). Inoltre, la larghezza tra le strutture di α-actinina 2 era significativamente più piccola delle hiCM di controllo (Figura 8D). Questi risultati sostengono che NMIIB è anche uno dei principali attori richiesti per l’assemblaggio di sarcomeri in hiCMs. Per confermare ulteriormente che la miosina II è necessaria per l’assemblaggio dei sarcomeri, abbiamo poi inibito farmacologicamente tutti i paraloghi della miosina II nelle hiCM con blebbistatina(Straight et al., 2003). le hiCM che si diffondevano in presenza di blebbistatina non erano in grado di assemblare le strutture dei sarcomeri(Figura 8-figure supplement 5). Mentre questi difetti nell’assemblaggio dei sarcomeri erano drammatici, abbiamo notato che gli hiCM trattati con siRNA contro NMIIA o NMIIB stavano ancora battendo prima della placcatura. Questo implicava che i sarcomeri preesistenti degli hiCM erano ancora intatti dopo il KD prima della placcatura. Pertanto, abbiamo immuno-localizzato α-actinina 2 per visualizzare i sarcomeri in hiCMs prima della placcatura. Sorprendentemente, abbiamo trovato che non ci sono state differenze tra il controllo, NMIIA, e NMIIB cellule KD prima della placcatura(Figura 8F e Figura 8-figure supplemento 6) Collettivamente, questi dati suggerirebbero NMIIA e NMIIB sono necessari per la formazione de novo sarcomeri, ma non omeostasi (cioè, il fatturato) di sarcomeri preesistenti.

NMIIB e FHOD3 sono necessari per la formazione organizzata della banda A

Finora i nostri risultati evidenziano l’importanza della polimerizzazione dell’actina mediata dalla forma e dell’NMII per una corretta architettura dei filamenti di actina durante l’assemblaggio dei sarcomeri. Abbiamo poi voluto affrontare il modo in cui i filamenti spessi della miosina II β cardiaca (βCMII ) al centro del sarcomero (cioè, banda A, Figura 1A ) si assemblano. Pertanto, abbiamo iniziato con la localizzazione di βCMII endogeno e filamenti NMIIB (Figura 9A). βCMII prevalentemente localizzato dietro NMIIB in strutture sarcomeriche organizzate e ha mostrato una localizzazione di picco ~ 15 micron dietro il bordo anteriore della cella, con una leggera area di sovrapposizione con NMIIB (Figura 9A eB). Abbiamo notato che l’area di sovrapposizione conteneva co-filamenti NMIIB-βCMII (Figura 9C e D, e Figura 9-figure supplement 1). Inoltre, abbiamo trovato anche co-filamenti NMIIA-βCMII in hiCMs (Figura 9-figure supplement 2). A nostra conoscenza, questa è la prima volta che è stata segnalata una specie di filamento di miosina II che contiene un paralogame non muscolare e muscolare all’interno delle cellule. Inoltre, abbiamo anche trovato co-filamenti di NMIIB-βCMII nei tessuti del topo e del cuore umano, indicando che i co-filamenti di NMIIB-βCMII sono presenti in vivo (Figura 9Ce Figura 9-figure supplement 1). I co-filamenti contenenti NMIIB e βCMII erano di lunghezza simile ai filamenti NMIIA/B (Figura 9D). Infatti, abbiamo notato che vicino al bordo di entrata della cellula, i filamenti βCMII sono tipicamente più piccoli e non organizzati in pile che assomigliano alle bande A (Figura 9A e C-E). Questo suggerisce che i filamenti βCMII sono polimerizzati sul bordo e successivamente diventano più grandi man mano che si allontanano dal bordo d’attacco (Figura 9E). La presenza di NMII prima che i filamenti βCMII crescano in filamenti più grandi ci ha portato a testare l’ipotesi che NMII avrebbe avuto un ruolo nella formazione dei filamenti βCMII.

Per verificare se il NMIIB era richiesto anche per la formazione del filamento βCMII e della banda A, abbiamo esaurito gli hiCMs di NMIIB e localizzato il βCMII 24 ore dopo la placcatura. Rispetto agli hiCMs di controllo, gli hiCMs KD-hiCMs NMIIB hanno mostrato una significativa diminuzione della capacità di formare strutture simili alla banda A (come definito nei Materiali e metodi) e un numero complessivo ridotto di filamenti βCMII (Figure 9F, G,I e K). Anche se si sono formati filamenti βCMII, erano altamente disorganizzati rispetto alle cellule di controllo, come valutato da Fourier transform (Pasqualiniet al., 2015) (Figura 9G). Come l’actina puncta rimasto dopo NMIIB KD conteneva α-acttinina 2 (Figura 9H), abbiamo ipotizzato che questi puncta potrebbe anche essere legato a filamenti βCMII. In effetti, abbiamo scoperto che i filamenti βCMII si estendevano alla distanza tra i puncta strettamente distanziati (Figura 9I). Questi dati suggeriscono che anche quando il citoscheletro dell’actina è gravemente perturbato, esistono ancora meccanismi che portano all’associazione tra esso e i filamenti βCMII. Abbiamo poi cercato di approfondire questa osservazione e di verificare se i difetti osservati nell’assemblaggio dei filamenti βCMII nel NMIIB KD hiCMs sono stati causati dalla perturbazione del citoscheletro dell’actina. Per testare questo, abbiamo permesso alle hiCM di formare sarcomeri per 18 ore, poi abbiamo trattato le hiCM con l’agente di sequestro dell’actina monomero Latrunculina B per 6 ore(Spector et al., 1983; Wakatsuki et al., 2001). Studi precedenti in cellule non muscolari hanno dimostrato che il trattamento con latrunculina elimina l’actina dalla maggior parte delle cellule e lascia aggregati di filamenti di actina sparsi nel citoplasma(Ayscough et al., 1997; Gronewold et al., 1999). Abbiamo anche trovato aggregati di filamenti di actina nella periferia di hiCM trattati con latrunculina(Figura 9-figure supplement 3). βCMII filamenti sembravano localizzare esclusivamente a questi aggregati, ma non erano in organizzato in bande A (Figura11I J). Presi insieme, questi risultati sostengono che l’organizzazione dei filamenti di actina è un fattore importante nell’organizzazione dei filamenti βCMII. Poiché FHOD3 KD ha anche portato ad una grave disorganizzazione dell’architettura dei filamenti di actina, abbiamo localizzato βCMII in questa condizione. Infatti, FHOD3 KD hiCM aveva anche disorganizzato i filamenti βCMII rispetto agli hiCM di controllo (Figura 9-figure supplement 4).

Per indagare ulteriormente i meccanismi di A-band assembly, abbiamo creato una lunghezza completa, umano βCMII costruire βCMII contenente un tag mEGFP sul dominio del motore (cioè, N-terminale) (Figura 11A). Questo costrutto correttamente integrato sia nei singoli filamenti che nelle miofibrille più mature(Figura 11A B). Nelle cellule U2OS non muscolari, le pile di filamenti NMIIA in banda A simili a pile di NMIIA sono spesso formate attraverso un processo chiamato ‘Espansione’ (Fenix etal., 2016). Durante l’Espansione, i filamenti NMIIA che sono vicini l’uno all’altro (cioè in un fascio stretto) si allontanano l’uno dall’altro nello spazio, ma rimangono parte dello stesso insieme, dove possono essere allineati in una pila simile alla miosina muscolare II nella banda A. Oltre all’espansione, i filamenti NMIIA sono anche, ma più raramente, “concatenati” (Fenix etal., 2016). La concatenazione è definita da filamenti NMIIA separati spazialmente che si muovono l’uno verso l’altro per creare una pila. Per testare come si formano le pile di filamenti βCMII, abbiamo ripetuto il nostro test di formazione di sarcomeri a cellule vive usando il nostro costrutto βCMII-mEGFP. In contrasto con i nostri precedenti risultati con NMIIA, abbiamo trovato che il principale meccanismo fisico della formazione di stack di filamenti βCMII è la concatenazione, dove i filamenti βCMII preesistenti si sono incrociati e cuciti insieme per formare la banda A (Figura11C E e Video 4) . Una piccola percentuale di hiCMs ha mostrato un evento di espansione di βCMII-mEGFP, tuttavia questo è stato significativamente meno frequente che nelle cellule non muscolari e non sembrano risultare in una più organizzata A-band (Figura 11D E). Infatti, ciascuno degli hiCMs quantificati nella Figura 11E ha mostrato un solo evento di espansione.

Discussione

L’obiettivo di questo studio è stato quello di affrontare una questione decennale riguardante l’origine dei sarcomeri che si assemblano in cardiomiociti. Alcuni laboratori hanno proposto che i sarcomeri derivino da un precursore simile a una fibra di stress, mentre altri propongono modelli in cui componenti di sarcomeri separati si uniscono in sequenza per formare sarcomeri(Holtzer et al., 1997; Lin et al., 1994; Lu et al., 1992; Rhee et al., 1994; Rui et al., 2010; Sanger et al., 2005). Sulla base della precedente colorazione dei filamenti di actina e della localizzazione NMII a queste fibre da stress, la nostra ipotesi iniziale era che i meccanismi alla base della polimerizzazione e dell’organizzazione dei filamenti di actina sarebbero stati correlati a quelli che governano le fibre non da stress muscolare note come archi di actina (vedi modello in Figura 12). A sostegno di questa ipotesi, sia i precedenti rapporti sui cardiomiociti non umani che il nostro lavoro con gli hiCM mostrano che l’organizzazione dell’actina di questi precursori appare identica agli archi di actina(Heath, 1983; Rhee et al., 1994; Sanger et al., 2005; Tojkander et al., 2012). Infatti, sia i MSF che gli archi di actina contengono NMII, si colorano continuamente di falloidina, si trovano sulla superficie dorsale della cellula e mostrano un flusso retrogrado in cui si allontanano dal bordo della cellula (Figura 12). Tuttavia, il nostro studio ha anche rivelato differenze distinte tra la regolazione e la dinamica delle MSF e gli archi di actina.

E ‘stato ben stabilito che i filamenti di actina di archi di actina in cellule non muscolari richiedono sia la nucleazione mediata dal complesso Arp2/3 e formine(Henson et al., 2015; Hotulainen e Lappalainen, 2006; Murugesan et al., 2016). I nostri dati suggeriscono che l’Arp2/3 non è formalmente richiesto per l’assemblaggio di MSF o di sarcomeri in hiCM. Tuttavia, il complesso Arp2/3 è localizzato ai margini degli hiCM, e sarà necessario un lavoro futuro per chiarire il suo ruolo in biologia cardiaca. A differenza del complesso Arp2/3, i nostri dati suggeriscono che le formine sono necessarie per l’assemblaggio di MSF e sarcomeri. In particolare, abbiamo trovato che la formina FHOD3 ha un ruolo importante nell’assemblaggio di MSF e sarcomeri(Figura 12). Questo si aggiunge al ruolo già consolidato di FHOD3 nell’omeostasi dei sarcomeri (cioè il turn-over)(Iskratsch et al., 2010; Kan-O et al., 2012; Taniguchi et al., 2009). In futuro sarà necessario un lavoro per chiarire il meccanismo preciso di come e dove l’FHOD3 potenzialmente nuclea i filamenti di actina nei sarcomeri. I filamenti di actina sarcomerica canonica hanno le loro estremità spinate incorporate all’interno di una linea Z (vedi schema in Figura 1A). Come tale, è qui che avremmo previsto la localizzazione dell’FHOD3. Tuttavia, i dati della nostra SIM mostrano che FHOD3 non localizza le linee Z(Figura 6F, riquadri 4, 5 e 6). Invece, FHOD3 sembra localizzare su entrambi i lati di ogni linea Z. Ciò potrebbe indicare che FHOD3 è solo transitoriamente associato alle estremità spinate dei filamenti di actina sarcomerica canonica. In alternativa, ci potrebbero essere estremità spinate dei filamenti di actina in questa regione, il che potrebbe indicare che l’organizzazione e/o la dinamica dei filamenti di actina all’interno di un sarcomero è più complessa. Infine, mentre FHOD3 KD mostrava il fenotipo più severo, KD di DAAM1 e DIAPH1 in hiCM ha portato a difetti sarcomerici e non sarcomerici nell’architettura dell’actina. Questo concorda con la letteratura precedente che mostra i ruoli per le formine multiple in cardiomiociti di topo spiegati nella manutenzione della struttura del sarcomero(Rosado et al., 2014). I diversi ruoli delle formine durante l’assemblaggio dei sarcomeri e la successiva manutenzione dovrebbero essere esplorati nei lavori futuri.

Dimostriamo anche che NMIIA e NMIIB sono necessari per il corretto assemblaggio dei sarcomeri nel nostro sistema di modelli hiCM. È interessante notare che i nostri dati suggeriscono che ogni motore può svolgere un ruolo diverso nell’assemblaggio dei sarcomeri. NMIIB KD ha portato a non rilevare il montaggio del sarcomero(Figura 8 e Figura 8-figure supplemento 4), suggerendo che NMIIB potrebbe essere richiesto per le fasi iniziali ed eventualmente successivi del montaggio. D’altra parte, NMIIA KD hiCMs sono stati in grado di assemblare i sarcomeri, anche se questi erano wispy con significativamente più breve Z-lines(Figura 8 e Figura 8-figure supplemento 3). Questo fenotipo NMIIA KD potrebbe essere il risultato di diverse possibilità, tra cui un ruolo di NMIIA nella maturazione, nell’allineamento o nella stabilità dei sarcomeri. Ovviamente, questo non è un elenco esaustivo dei potenziali meccanismi. Oltre a mostrare NMIIA e NMIIB erano necessari per l’assemblaggio dei sarcomeri, mostriamo che NMIIA e NMIIB formano co-filamenti di miosina II con βCMII. I filamenti βCMII trovati nei co-filamenti erano relativamente piccoli, (~300 nm), e successivamente sono diventati più grandi man mano che passavano ai filamenti più grandi della banda A (~1,6 micron), e hanno perso NMII. Singoli filamenti βCMII individuali (o un piccolo fascio al di sotto del limite di risoluzione della nostra modalità di imaging) concatenati per formare le pile di filamenti βCMII della banda A. Questo processo richiede la presenza di tracce di actina(Figura 12).

Collettivamente, i nostri dati forniscono una nuova visione meccanicistica e dinamica dell’assemblaggio dei sarcomeri e mettono in evidenza le differenze chiave tra le fibre classiche, ben studiate, non muscolari da stress, e le MSF nei miociti cardiaci(Figura 12). Inoltre, il nostro modello unifica alcuni aspetti dei modelli di assemblaggio dei sarcomeri precedentemente proposti(Figura 12). Questi modelli precedentemente proposti, pur essendo presentati come reciprocamente esclusivi l’uno dall’altro, sono in realtà abbastanza simili sotto certi aspetti. Evidenziando questo, i nostri dati supportano una caratteristica importante condivisa tra il modello di modello e il modello di Pre-Myofibril. In particolare, le fibre stressanti sono precursori dei sarcomeri contenenti miofibrille. Queste fibre da sforzo sono state originariamente chiamate “strutture simili alle fibre da sforzo” quando è stato proposto il Modello di Modello (Dlugoszet al., 1984; Sanger et al., 2005). Più tardi furono rinominate Pre-Myofibrils al posto di una caratterizzazione più approfondita(Rhee et al., 1994; Sanger et al., 2005). È stato dimostrato che queste fibre da stress non contenevano le stesse proteine delle fibre non da stress muscolare(Rhee et al., 1994). Tuttavia, la maggior parte delle proteine note nelle fibre da stress che si trovano nei cardiomiociti hanno paraloghi nelle fibre non da stress muscolare. Come tali, troviamo che le “strutture simili alle fibre da stress” siano una descrizione appropriata. Pertanto, suggeriamo di chiamare semplicemente queste strutture ‘fibre da sforzo’ è preferibile. In questo studio, stiamo confrontando i meccanismi di regolazione della fibra non muscolare stress fibra di cui si fa riferimento come archi di actina, ai precursori di sarcomeri nei miociti cardiaci. Così, abbiamo deciso di chiamarle fibre da stress muscolare (MSF) per evitare confusione.

I nostri dati supportano il concetto che le MSF si trasformano nel tempo in miofibrille contenenti sarcomeri. Questo è il modo in cui vengono presentati i modelli a cartoni animati sia del Modello che dei Modelli di Pre-Miofibrilla (vedi modelli originali(Dlugosz et al., 1984; Rhee et al., 1994)). Rimane aperta la questione se ci sia un vero modello durante questo processo. Il modello originale del modello presupponeva che le “strutture simili alle fibre da sforzo” [MSF] sarebbero scomparse dopo essere state usate come modello per costruire una miofibrilla (Dlugoszet al., 1984). Mentre alcuni componenti di MSF (ad esempio, α-actinina 2) sembrano persistere durante la transizione da MSF a sarcomero, altri chiaramente non lo fanno (ad esempio, NMIIA/B). Inoltre, i nostri dati suggeriscono che i filamenti NMIIA/B potrebbero essere essi stessi un modello per l’aggiunta di βCMII, poiché tutti e tre i paraloghi possono essere trovati in co-filamenti insieme nella regione in cui NMIIA/B e βCMII si sovrappongono. Oltre ai modelli Templating/Pre-myofibril, i nostri dati supportano anche gli aspetti del modello di cucitura. Il modello di cucitura originariamente proponeva che i componenti preassemblati del sarcomero (cioè, le bande A e i corpi I-Z-I) sarebbero stati cuciti insieme in sequenza per formare una miofibrilla(Holtzer et al., 1997). Non abbiamo rilevato corpi I-Z-I preformati o bande A nel nostro saggio(Figura 1-figure supplement 1) o assemblaggio sequenziale di sarcomeri per formare una miofibrilla (Figura 1). Tuttavia, alcuni aspetti della dinamica βCMII giustificano il confronto con il modello di cucitura. Abbiamo trovato filamenti βCMII separati concatenati e “cuciti” insieme per formare pile di filamenti βCMII più grandi (cioè la banda A) (Figura 11C).

I nostri dati mostrano la transizione di un MSF ad un sarcomero contenente miofibrilla si verifica sulla superficie dorsale (in alto) della cellula. Tuttavia, un recente studio anche imaging iPSC derivati miociti cardiaci sostiene che i sarcomeri si formano sulla superficie ventrale (in basso) della cellula vicino adesioni matrice extracellulare(Chopra et al., 2018). Questo gruppo riferisce anche che i primi sarcomeri si formano tra le 24 e le 48 ore dopo la placcatura, ben dopo che abbiamo rilevato la comparsa dei primi sarcomeri (Chopra et al., 2018). Questo ci ha portato a chiederci cosa potrebbe portare a questi due risultati apparentemente opposti. È importante notare che questo gruppo sembra essere stato immaginato come la superficie ventrale (in basso) dei loro miociti, dato che il focus del loro studio era sulle aderenze focali. Un attento esame dei loro filmati time-lapse ha rivelato strutture sbiadite e sfocate che corrispondono a modelli sarcomerici che compaiono nell’inquadratura proprio prima della comparsa dei sarcomeri. Questo supporta l’idea che si tratta di sarcomeri di imaging che stanno entrando a fuoco, e non di assemblaggi “de novo”. Per testare questa idea, abbiamo immaginato gli hiCM con la microscopia confocale 3D dopo che erano stati placcati per 24 ore(Figura 12-figure supplement 1). Mentre vediamo anche modelli simili di sarcomeri che appaiono sulla superficie ventrale come(Chopra et al., 2018), i nostri dati hanno rivelato che questi sarcomeri si muovono verso il basso dalla superficie dorsale e non si assemblano sulla superficie ventrale(Figura 12-figure supplement 1 e Video 5). Di interesse, il fenomeno degli archi di actina che si spostano verso la superficie ventrale delle cellule non muscolari è stato riportato anche in precedenza(Gao et al., 2012; Hotulainen e Lappalainen, 2006). Infine,(Chopra et al., 2018) sostengono anche che né la NMIIA né la NMIIB sono necessarie per l’assemblaggio dei sarcomeri. Anche questo ci sembra strano. Mentre il loro doppio NMIIA/NMIIB knockout (KO) linea di cellule cardiomiocitarie ha strutture positive α-actinina 2, non contengono linee Z continue etichettate allineate parallelamente l’una all’altra paragonabile alla linea delle cellule di controllo. Gli autori non hanno misurato le lunghezze delle linee Z, la spaziatura o altri criteri necessari per definire i sarcomeri. Queste discrepanze tra il nostro studio e il loro, compreso il ruolo della NMII, devono essere armonizzate, in quanto influiranno direttamente sulla nostra interpretazione dei futuri dati in vivo relativi all’assemblaggio dei sarcomeri.

I dati degli studi in vivo che cercano di rispondere alla domanda del contributo NMII all’assemblaggio dei sarcomeri nei topi sono stati difficili da interpretare(Sparrow e Schöck, 2009). I topi NMIIA KO di Germline non riescono a gastrurare e quindi l’assemblaggio dei sarcomeri è impossibile da esaminare(Conti et al., 2004). Un topo NMIIA KO condizionale è stato generato utilizzando un promotore che si attiva dopo l’inizio della formazione del cuore, e non sono stati rilevati difetti cardiaci(Conti et al., 2015). Un topo NMIIB KO germline ha formato un cuore funzionale, anche se la maggior parte dei cuccioli è morta prima della nascita a causa di un’insufficienza cardiaca(Tullio et al., 1997). È stata mostrata solo un’immagine ad alto ingrandimento dell’animale KO, che ha dimostrato una grave disorganizzazione del sarcomero(Tullio et al., 1997). Di interesse, gli animali NMIIB KO hanno anche mostrato livelli di proteina NMIIA altamente aumentati rispetto ai controlli(Tullio et al., 1997). Così, la capacità osservata di questo animale di formare strutture simili a quelle dei sarcomeri potrebbe essere dovuta alla compensazione genetica da parte di NMIIA. Un topo KO NMIIB condizionale è stato anche fatto(Ma et al., 2009). Mentre gli autori hanno mostrato un impressionante KD NMIIB nel cervelletto attraverso un driver neuronale specifico, c’erano alti livelli di proteina NMIIB nel cuore al momento dell’analisi nel KO specifico del cuore(Ma et al., 2009). Inoltre, il KO condizionale specifico del cuore è spinto fuori dal promotore della catena pesante della miosina alfa, che si accende dopo l’inizio dell’assemblaggio del sarcomero e in effetti dopo che i campi del cuore hanno iniziato a battere(Ma et al., 2009; Ng et al., 1991). A complicare ulteriormente la questione, l’NMIIB è stato difficile da localizzare nel tessuto. Riteniamo che questo sia il risultato dell’incorporazione della paraffina e dei successivi protocolli di rimozione e reidratazione della paraffina. Per esempio, abbiamo localizzato con successo l’NMIIB nel tessuto umano e nel topo fissato in formalina(Figura 9 e Figura 9-figure supplement 1), ma non siamo riusciti a localizzare l’NMIIB nel tessuto paraffinico incorporato. I futuri confronti tra i set di dati in vivo e in vitro dovranno essere affrontati.

Rimangono da testare anche domande intriganti e senza risposta. Ad esempio, come vengono stabiliti e mantenuti i gradienti osservati di NMII e βCMII nei miociti cardiaci? Tali domande sono state in precedenza da difficili a impossibili da testare a causa di sistemi modello complicati e tecnicamente impegnativi. Qui presentiamo un sistema modello relativamente facile da usare per testare queste domande. Gli hiCM che utilizziamo in questo studio sono disponibili in commercio. I nostri metodi delineano protocolli per la trasfezione con DNA per l’espressione delle proteine e siRNA per il knockdown delle proteine, e protocolli di tripsinizzazione per la ri-placcatura. Andando avanti, crediamo che gli studi che utilizzano l’impostazione sperimentale che descriviamo qui non solo continuerà a chiarire i modelli precedenti, ma anche rivelare nuove intuizioni sia l’assemblaggio di sarcomeri, e la biologia delle cellule cardiache.

Materiali e metodi

Tabella delle risorse chiave.
Tipo di reagente (specie) o risorsa	Designazione	Fonte o riferimento	Identificatori	Ulteriori informazioni
Linea cellulare (umana)	iCell Cardiomiociti^2	Dinamica cellulare internazionale		miociti cardiaci derivati dall’ipsc
Linea cellulare (umana)	Cardiomiociti Cor.4U	Ncardia (ex Axiogenesi)		miociti cardiaci derivati dall’ipsc
Linea cellulare (umana)	HeLa	Collezione americana della cultura del tipo (ATCC)	CCL-2
Linea cellulare (umana)	U2-OS	Collezione americana della cultura del tipo (ATCC)	HTB-96
Reagente DNA ricombinante	pHalo-NMHC IIA-C18	questo documento		vedi Materiali e metodi per i dettagli sulla creazione
Reagente DNA ricombinante	pHalo-NMHC IIB-C18	questo documento		vedi Materias e metodi per i dettagli sulla creazione
Reagente DNA ricombinante	α-acttinina-2-mEmeraldo	Addgene	53988
Reagente DNA ricombinante	α-acttinina-2-tdEOS	Addgene	57577
Reagente DNA ricombinante	NMIIA-(N-terminale)-mEGFP	Addgene	11347
Reagente DNA ricombinante	Lifeact-mEmerald	Regalo di Michael Davidson
Reagente DNA ricombinante	Lifeact-mApple	Regalo di Michael Davidson
Reagente DNA ricombinante	NMIIB-(N-terminale)-mEmerald	Addgene	54192
Reagente DNA ricombinante	FHOD-mEGFP (manca l’esone T(D/E)5XE)	Regalo della Dott.ssa Elizabeth Ehler	Iskratsch et al. (2010)
Reagente DNA ricombinante	βCMII-mEGFP	Genescript (Piscataway, NJ, USA) questo documento		vedi Materiali e metodi per i dettagli sulla creazione
Reagente DNA ricombinante	p16b-eGFP	Regalo della Dr. Jenniffer Lippincott-Schwartz e della Dr. Pekka Lappalainen	Lai, F. P., et al 2008.Koestler et al., 2013.
Anticorpo	coniglio IgG policlonale IgG anti-NMIIA	Biolegend	P909801	Usato a 1:1000
Anticorpo	coniglio IgG policlonale IgG anti-NMIIB	Segnalazione cellulare	P3404S	Usato a 1:200
Anticorpo	coniglio IgG policlonale IgG anti-NMIIB	Biolegend	909901	Usato a 1:200
Anticorpo	topo monoclonale IgG anti-βCMII	Banca Ibridioma Iowa	A4.1025	Usato a 1:2
Anticorpo	coniglio IgG policlonale IgG anti-α-actinina-2	Sigma-Aldrich	clone EA-53	Usato a 1:200
Anticorpo	coniglio policlonale IgG anti-p34-Arc/ArpC2 (complesso Arp2/3)	Millipore Sigma	07–227	Usato a 1:100
Anticorpo	coniglio IgG policlonale IgG anti-DAAM1	Laboratori Bethyl	HPA026605	Usato a 1:100
Anticorpo	coniglio IgG policlonale IgG anti-DIAPH1	Sigma-Aldrich	A300-078A	Usato a 1:100
Anticorpo	topo monoclonale IgGanti-cardiaco troponina T	Santa Cruz Biotecnologia	CT3, sc-20025	Usato a 1:50
Anticorpo	capra anti-topo IgG Alexa Fluor 568	ThermoFisher Scientific	A-11004	Usato a 1:100
Anticorpo	capra anti coniglio IgG Alexa Fluor 568	ThermoFisher Scientific	A-11011	Usato a 1:100
Anticorpo	capra anti-topo IgG Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	AA28175	Usato a 1:100
Anticorpo	capra anti coniglio IgG Alexa Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-21244	Usato a 1:100
Anticorpo	capra anti-topo IgM Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21042	Usato a 1:100
Anticorpo	mouse monoclonale IgG anti-FHOD3	Santa Cruz Biotecnologia	G-5, sc-374601	Usato a 1:100
Reagente a base di sequenza	SmartPool siRNA DIAPH1	GE Dharmacon	E-010347-00-0005
Reagente a base di sequenza	SmartPool siRNA DAAM1	GE Dharmacon	E-012925-00-0005
Reagente a base di sequenza	SmartPool siRNA FHOD3	GE Dharmacon	E-023411-00-0005
Reagente a base di sequenza	SmartPool siRNA MYH10 (NMIIB)	GE Dharmacon	E-023017-00-0010
Reagente a base di sequenza	SmartPool siRNA MYH9 (NMIIA)	GE Dharmacon	E-007668-00-0005
Saggio commerciale o kit	Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Saggio commerciale o kit	QIAprep spin Kit Miniprep (250)	Qiagen	27106
Composto chimico, farmaco	Blebbistatina	Sigma-Aldrich	B0560
Composto chimico, farmaco	LatrunculinB	Sigma-Aldrich	L5288
Composto chimico, farmaco	LatrucluinA	Sigma-Aldrich	L5163
Composto chimico, farmaco	CK666	Sigma-Aldrich	SML0006
Composto chimico, farmaco	SMIFH2	Sigma-Aldrich	S4826
Composto chimico, farmaco	TransIT-TKO	Mirus Bio	MIR 2150
Composto chimico, farmaco	FuGENE HD	Promega	E2311
Composto chimico, farmaco	Alexa Fluor 488 Falloidina	ThermoFisher Scientific	A12379
Composto chimico, farmaco	Viafect	promega	E4981
Software, algoritmo	(Fiji è solo) ImageJ	NIH (open source)

Contatto per la condivisione di reagenti e risorse

Ulteriori informazioni e richieste di risorse e reagenti devono essere indirizzate e saranno soddisfatte dal Lead Contact, D.T.B. (dylan.burnette@vanderbilt.edu)

Modello sperimentale e dettagli del soggetto

Crescita della linea cellulare e condizioni sperimentali

I cardiomiociti staminali pluripotenti indotti dall’uomo (hiCM) sono stati acquistati da Axiogenesis (Cor.4u, Ncardia Cologne, Germania) o da Cellular Dynamics International (iCell caridomyocytes2, Madison, WI). Le cellule sono state coltivate secondo le istruzioni del produttore. hiCMs sono stati coltivati in 96 piastre pozzo e mantenuto in produttore proprietario fornito supporti fino a quando non è pronto per l’uso sperimentale. Esperimenti Knockdown in hiCMs sono stati avviati 4 giorni dopo il disgelo iniziale. Vedere il test di placcatura per un protocollo più dettagliato per la placcatura delle cellule. Vedi sotto per informazioni dettagliate sulla trasfezione di proteine e knockdown mediato da siRNA

Le cellule U-2 OS e HeLa (HTB-96; American Type Culture Collection, Manassas, VA) sono state coltivate in flaconi da 25 cm2 (25-207; Genessee Scientific Corporation, San Diego, CA) con un mezzo di crescita comprendente DMEM (10-013-CV; Mediatech, Manassas, VA) contenente 4.5 g/L di L-glutammina, D-glucosio e piruvato di sodio e integrato con il 10% di siero bovino fetale (F2442; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Per gli esperimenti di espressione delle proteine nelle cellule U-2 OS, le cellule sono state transitoriamente trasfettate con FuGENE 6 (E2691; Promega, Madison, WI) secondo le istruzioni del produttore. Knockdown di NMIIA e NMIIB è stata eseguita come in precedenza, con il siRNA Accell SMARTpool siRNA umano MYH9, MYH10 o controllo Accell strapazzato acquistato da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) in combinazione con Lipofectamina 2000 Reagente Trasfezione (cat # 11668027, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) per le cellule HeLa. Sia per la microscopia a cellule vive che per la microscopia a cellule fisse, le cellule sono state placcate e riprese su piatti con fondo in vetro da 35 mm con un micropozzetto da 10 mm #1,5 di vetro di copertura (Cellvis, Mountain View, CA) rivestito con 25 µg/mL di laminina (114956-81-9, Sigma-Aldrich).

Plasmidi

I plasmidi che codificano NMIIA-(N-terminal)-mEGFP (11347; Addgene, Cambridge, MA) con mEGFP sul N-terminale della catena pesante NMIIA sono stati utilizzati come descritto in precedenza(Chua et al., 2009). La codifica Plasmid Lifeact-mEmerald e Lifeact-mApple sono stati doni di Michael Davidson. La codifica Plasmide NMIIB-(N-terminal)-mEmerald è stata acquistata da Addgene (54192; Addgene, Cambridge, MA). La codifica plasmidica α-actinina 2-tdEOS è stata acquistata da Addgene (57577; Addgene, Cambridge, MA). La codifica del plasmide βCMII umano è stata sintetizzata da Genscript (Piscataway, NJ, USA). In breve, la wild-type human MYH7 (βCMII) sequenza di tipo umano MYH7 (βCMII) dal National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) è stata clonata in un pUC57 insieme a Gateway sequenze di ricombinazione del DNA al fine di facilitare la rapida integrazione e lo scambio di proteine fluorescenti (Gateway Technology, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). mEGFP contenente una sequenza linker precedentemente pubblicata è stata aggiunta al plasmide βCMII utilizzando il sistema di conversione vettoriale Gateway Vector Conversion System con cellule di sopravvivenza ccdB One Shot (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) per il costrutto βCMII-(N-terminal)-mEGFP utilizzato in questo studio. Il plasmide FHOD3-mEGFP privo dell’esone T(D/E)5XE è stato un regalo di Elizabeth Ehler. Questo costrutto è stato precedentemente mostrato per localizzare i sarcomeri in cardiomiociti di ratto neonatale(Iskratsch et al., 2010) (vedi pannello in alto a sinistra della Figura 2A in riferimento). L’assemblaggio di pHalo-NMHC IIB-C18: pEmerald-NMHC IIB-C18 (Addgene, #54192) è stato il gentile dono di Michael Davidson. Halo tag cDNA è stato PCR amplificato da pHalo-N1 e subclonato nel sito di Age I/BspEI mEmerald di pEmerald-NMHC IIB-C18, sostituendo mEmerald, per generare la sequenza verificata di pHalo-NMHC IIB-C18. Montaggio di pHalo-NMHC IIA-C18 (NMIIA-HaLo): Il frammento di cDNA NheI/BspEI Halo Halo dal costrutto pHalo-NMHC IIB-C18 è stato subclonato nel sito NheI/BspEI mEmerald di pEmerald-NMHC IIA-C18 (Addgene, #54190)(Burnette et al., 2014), sostituendo mEmerald, per generare la sequenza verificata del costrutto pHalo-NMHC IIA-C18. Il plasmide pEGFP-p16b (per visualizzare il complesso Arp2/3) è stato un regalo del Dr. Pekka Lappalainen e precedentemente pubblicato(Koestler et al., 2013; Lai et al., 2008).

Etichettatura Halo-tag

hiCM esprimendo costrutti Halo-tag sono stati etichettati con JF Dye 585 a diluizione 1:100 in terreno di coltura preriscaldato per 1 ora. La piastra è stata poi lavata scambiando delicatamente con il terreno di coltura fresco per 3 volte(Grimm et al., 2017; Grimm et al., 2015)

Autenticazione della linea cellulare

La linea cellulare HeLa utilizzata in questo studio è stata un regalo del Dr. DA Weitz (Università di Harvard). Il laboratorio Burnette ha fatto autenticare questa linea da Promega e ATCC utilizzando il loro ‘Cell Line Authentication Service’ nel 2015. I metodi e i risultati dei test ricevuti da Promega e ATCC sono i seguenti:

“Metodologia: Diciassette loci a breve ripetizione tandem (STR) più il locus che determina il genere, l’Amelogenina, sono stati amplificati utilizzando il kit PowerPlex 18D di Promega disponibile in commercio. Il campione della linea cellulare è stato elaborato utilizzando l’analizzatore genetico ABI Prism 3500xl. I dati sono stati analizzati utilizzando il software GeneMapper ID-X v1.2 (Applied Biosystems). Sono stati eseguiti e confermati adeguati controlli positivi e negativi per ogni campione presentato”.

“Interpretazione dei dati”: Le linee cellulari sono state autenticate utilizzando l’analisi Short Tandem Repeat (STR) come descritto nel 2012 in ANSI Standard (ASN-0002) Authentication of Human Cell Lines: Standardizzazione del profilo STR da parte dell’Organizzazione per lo sviluppo degli standard ATCC (SDO)”.

“Risultati dei test”: Il profilo presentato corrisponde esattamente alle seguenti linee cellulari umane ATCC nel database ATCC STR (otto loci principali più Amelogenina): CCL-2 (HeLa)”.

La linea cellulare U2 OS utilizzata in questo studio è stata acquistata direttamente da ATCC dal laboratorio Burnette nel 2014 (ATCC, HTB-96). Monitoraggio dei micoplasmi: Sia HeLa e U2 linee cellulari OS sono stati controllati per potenziale infezione da micoplasma utilizzando sia DAPI o Heoscht durante tutto il corso di questo studio.

Live-Cell test di visualizzazione del montaggio del sarcomero

Per visualizzare la formazione di sarcomeri, abbiamo sviluppato un metodo ripetibile, che può essere utilizzato per visualizzare qualsiasi proteina marcata fluorescentemente durante la formazione di sarcomeri in hiCM. Prima di eseguire questo saggio, le cellule sono mantenute nel vaso di coltura desiderato (i nostri hiCMs sono stati mantenuti in 96 piastre di pozzo). In questo saggio, le cellule sono transitoriamente trasfettate con la proteina desiderata fluorescente taggato, tripsinizzato, placcato sul piatto di imaging desiderato, e ripreso per osservare la formazione di sarcomeri. Un test di assemblaggio sarcomero procede come segue. In primo luogo, hiCMs sono trasfettati con la proteina desiderata fluorescente taggato come descritto di seguito (Viafect, trasfezione durante la notte). La miscela di trasfezione viene lavata via con i mezzi di coltura. Le cellule vengono poi staccate dal vaso di coltura utilizzando il metodo di tripsinizzazione descritto di seguito. Le cellule sono poi placcati su un vaso di coltura desiderato (in questo studio, 10 mm # 1,5 piatti di vetro di fondo sono stati utilizzati, CellVis, Mountain View, CA) per l’imaging cellulare vivo. I vasi di imaging sono stati pre-rivestiti con 25 µg/mL di lamina per 1 ora a 37° C e lavati con 1x PBS contenente Mg2+/Ca2+. Le cellule sono stati autorizzati ad attaccare per ~ 1,5 ore e media è stato aggiunto per riempire il piatto fondo di vetro. Le cellule sono stati poi ripresi utilizzando la modalità di imaging desiderato a 3-6 ore post placcatura. La finestra temporale di 3-6 ore era ottimale, in quanto le cellule non avevano ancora stabilito sarcomeri, ma erano abbastanza sani per tollerare la fluorescenza di imaging. Questo potente test può essere adattato per visualizzare la cinetica durante la formazione di sarcomeri di qualsiasi proteina marcata con fluorescenza. Abbiamo usato questo test per visualizzare l’actina (Lifeact), FHOD3, βCMII, α-actina 2, NMIIA e NMIIB. Queste ultime due proteine sono grandi (cioè, >250 KD).

Tripsinizzazione degli hiCM

Per tentare la tripsinizzazione degli hiCM Cellular Dynamics, sono state utilizzate le raccomandazioni dei produttori, come segue. Tutti i volumi applicati sono stati modificati dal formato a 24 pozzetti per 96 piastre a pozzetto. hiCMs sono stati lavati 2x con 100 uL 1x PBS senza Ca2+/Mg2+ (PBS*). PBS * è stato completamente rimosso da hiCMs e 40 uL 0,1% Trypsin-EDTA senza rosso fenolo (Invitrogen) è stato aggiunto a hiCMs e posto a 37 ° C per 2 min. Dopo l’incubazione, piatto di coltura è stato lavato 3x con tripsina all’interno del pozzo, ruotato di 180 gradi, e lavato un altro 3x. Tripsinizzazione è stato poi estinto con l’aggiunta di 160 µL di terreno di coltura e la miscela cellulare totale è stato posto in una provetta Eppendorf 1,5 mL. Le cellule sono state filate a 1000 g per 5 minuti, e il surnatante è stato aspirato. Le cellule sono state poi risospese in 200 uL di terreno di coltura e placcato su un piatto di vetro di 10 mm di fondo pre-rivestito con 25 µg / ml di lamina per 1 ora. Le cellule sono stati poi permesso di attaccare per almeno 1 ora, e 2-3 mLs di mezzi di coltura con o senza farmaco è stato aggiunto alle cellule.

Per trypsinize Axiogenesis hiCMs, le raccomandazioni dei produttori sono stati utilizzati, come segue. Le cellule sono state lavate 2x con 500 µL PBS*. Le cellule sono state poste in incubatrice a 37° C per 7 minuti in PBS*. Dopo 7 minuti, PBS * è stato aspirato e 40 µL 0,5% tripsina 0,5% (Invitrogen) è stato posto sulle cellule per 3 minuti in 37 ° C incubatrice. Dopo 3 min, 160 µL pieno Cor.4u media è stato utilizzato per estinguere tripsinizzazione e risospendere le cellule. Le cellule sono stati poi placcati su un piatto di vetro pre-rivestito fondo piatto e media aggiunto 1,5 ore dopo per diluire tripsinatura e riempire la camera. Nota * questo protocollo di tripsinizzazione è stato poi modificato da Axiogenesis (ora Ncardia). Vedi produttore per il nuovo protocollo.

È importante notare che il protocollo di tripsinizzazione si basa sui protocolli dei produttori di hiCMs per la placcatura delle cellule, e questi hiCMs sono stati tripsinizzati prima di saggi funzionali delle prestazioni cardiomiocitarie e la caratterizzazione (ad esempio, la risposta al farmaco, elettrofisiologia, maturazione, ecc …) (Fineet al., 2013; Ivashchenko et al., 2013; Mioulane et al., 2012).

Trasfezione transitoria di hiCM

Gli hiCM Cellular Dynamics sono stati trasfettati modificando le raccomandazioni del produttore come segue. I volumi utilizzati sono per la trasfezione in 96 piastre a pozzetto. A 6 µL Opti-MEM sono stati aggiunti 2 µL di plasmide totale 200 ng (contenente la proteina di interesse marcata con fluorescenza, diluita in Opti-MEM) e 2 µL di Viafect diluito 1:5 (Promega, E4981, in Opti-MEM). L’intera miscela di 10 µL è stata aggiunta a 96 pozzetti singoli di hiCM contenenti 100 µL di terreno di coltura completo appena scambiato. La trasfezione è stato permesso di andare durante la notte (~ 15 ore), e lavato 2x con mezzi di coltura completa. Per la trasfezione di sonde multiple, 2 µL di 200 ng di plasmide ng è stato utilizzato per ogni sonda insieme a 4 µL 1:5 diluito Viafect, in 2 µL Opti-MEM e la miscela è stata applicata alle cellule come sopra.

Axiogenesis hiCMs sono stati trasfettati attraverso la modifica delle raccomandazioni del produttore come segue. Un rapporto 3,5:1 Fugene a DNA è stato utilizzato per trasfettare Axiogenesis hiCMs. 1,2 µL di fuugenio +0,33 µg di DNA per 96 pozzetti in 5 µL di siero libero Cor.4u media è stato incubato per 15 minuti a temperatura ambiente. 95 µL media Cor.4u pieno è stato aggiunto alla miscela e l’intera miscela è stata aggiunta a hiCMs (in cima a 100 µL già in pozzo). Per la trasfezione di 2 plasmidi separati, rapporto 3,5:1 è stato utilizzato per entrambi i plasmidi e volume aggiuntivo è stato sottratto da 95 µL diluizione. Nota* questo protocollo di trasfezione è stato modificato dall’assiogenesi. Vedere il produttore per il nuovo protocollo.

Abbattimento delle proteine

Gli hiCM Cellular Dynamics sono stati utilizzati per esperimenti di knockdown attraverso la modifica delle raccomandazioni dei produttori. I volumi utilizzati sono per l’applicazione di siRNA in 96 piastre a pozzo. Dharmacon SmartPool siRNA (GE Dharmacon, Lafayette, CO) destinati a MYH9 (NMIIA), MYH10 (NMIIB), FHOD3, DAAM1, e DIAPH1 sono stati utilizzati (E-007668-00-00-00-0005, E-023017-00-0010, E-023411-00-00-00-0005, E-012925-00-00-00-0005, e E-010347-00-00-0005, rispettivamente). Per ottenere KD, una miscela master di 100 μl Opti-MEM (ThermoFisher, Waltham, MA)+4 μl Transkit-TKO (Mirus Bio, Madison WI)+5,5 μl 10 μM siRNA è stato incubato per 30 minuti a temperatura ambiente. 80 μl di media freschi, pre-riscaldati è stato aggiunto a hiCMs. Dopo l’incubazione di miscela siRNA, 8,3 microlitri di miscela è stato aggiunto ad ogni singolo pozzo di 96 piastra pozzo. hiCMs sono stati poi incubati per 2 giorni a 37 ° C. hiCMs sono stati poi lavati 2x con fresco, pre-riscaldato media. Per ottenere KD di NMIIA, NMIIB, FHOD3, DAAM1, e DIAPH1, 3 turni di siRNA mediato KD descritto sopra sono stati necessari. A seguito di 3 turni di trattamento siRNA di controllo scramble siRNA, hiCMs ancora battere e mantenuto la struttura del sarcomero (vediFigura 8-figure supplemento 6).

Esperimenti farmacologici

Per tutti gli esperimenti farmacologici, i farmaci sono stati aggiunti ai mezzi di comunicazione preriscaldati ed equilibrati prima di aggiungerli alle hiCM. Per i saggi di assemblaggio del sarcomero, 25 μM SMIFH2 (Sigma-Aldrich, S4826), 25 μM CK666 (Sigma-Aldrich, SML0006), e 100 μM Blebbistatina (Sigma-Aldrich, B0560) (separatamente) sono stati aggiunti 1,5 ore dopo la placcatura per consentire hiCMs di attaccare al substrato. hiCMs sono stati successivamente fissati (vedi sotto) a 24 ore post placcatura. Per gli esperimenti di cellule vive (come in Figura 5D), media in contenitore di imaging è stato aspirato utilizzando un sistema di vuoto, e media contenenti droga è stato aggiunto al hiCMs sul microscopio fase. Questo ha permesso la stessa hiCM per essere imaged stesso hiCM pre e post-applicazione di droga. Per l’esperimento LatrunculinB(Figura 9J), le cellule sono stati autorizzati a diffondersi per 18 ore in media normali, e media contenenti 5 μM LatrunculinB (Sigma-Aldrich, L5288) è stato aggiunto per 6 ore e hiCM sono stati fissati (per un tempo totale di diffusione di 24 ore).

Macchia occidentale

I campioni di gel sono stati preparati miscelando i lisati delle cellule con il buffer di campioni LDS (Life Technologies, #NP0007) e il buffer di riduzione del campione (Life Technologies, #NP00009) e bolliti a 95°C per 5 min. I campioni sono stati risolti su gel di Bis-Tris a gradiente Bolt 4-12% (Life Technologies, #NW04120BOX). Le bande di proteine sono state tamponate su una membrana di nylon (Millipore). Le macchie sono state bloccate usando 5% NFDM (Research Products International Corp, Mt. Prospect, IL, #33368) in TBST. Incubazioni di anticorpi sono state eseguite anche in 5% NFDM in TBST. I blot sono stati sviluppati utilizzando il kit di chemiluminescenza Immobilon (Millipore, #WBKLS0500).

Fissazione e immunoistochimica

hiCMs e cellule HeLa sono stati fissati con il 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS a temperatura ambiente per 20 minuti e poi estratti per 5 minuti con 1% Tritone X-100% e 4% PFA in PBS come descritto in precedenza(Burnette et al., 2014). Le cellule sono state lavate tre volte in 1 × PBS. Per visualizzare βCMII endogeno e proteine trasfettate in cellule fisse, hiCMs sono stati estratti cellule vive prima della fissazione come descritto in precedenza per ridurre i filamenti di fondo e non citoscheletrico miosina II filamenti (cioè, il pool solubile). In breve, un citoscheletro-stabilizzante tampone di estrazione a cellule vive è stato fatto fresco contenente 2 ml di soluzione madre (500 mM acido 1,4-piperazinedietansolfonico, 25 mM acido etilenglicole tetraacetico, 25 mM MgCl2), 4 ml di 10% di poliossietilene glicole (PEG; 35.000 peso molecolare), 4 ml di_H2O, e 100 μl di Triton X-100, 10 μM di paclitaxel e 10 μM di falloidina. Le cellule sono state trattate con questo tampone di estrazione per 1 minuto, seguito da un lavaggio di 1 minuto con tampone di lavaggio (tampone di estrazione senza PEG o Triton X-100). Le cellule sono state poi fissate con il 4% di PFA per 20 minuti. Dopo la fissazione, sono state utilizzate le seguenti procedure di etichettatura: per la visualizzazione dell’actina, la falloidina-488 in 1 × PBS (15 μl di falloidina di riserva per 200 μl di PBS) è stata utilizzata per 3 ore a temperatura ambiente. Per gli esperimenti di immunofluorescenza, le cellule sono state bloccate nel 10% di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS. Gli anticorpi primari sono stati diluiti in BSA al 10%. L’anticorpo NMIIA (BioLegend, P909801) è stato utilizzato a 1:1000. L’anticorpo NMIIB (Cell Signaling, 3404S e BioLegend 909901) è stato usato a 1:200. L’anticorpo βCMII (Iowa Hybridoma Bank, A4.1025) è stato usato non diluito dal siero. L’anticorpo α-actinina 2 (Sigma-Aldrich, clone EA-53) è stato usato a 1:200. L’anticorpo FHOD3 (Santa Cruz Biotechnology, G-5, sc-374601) è stato utilizzato a 1:100. L’anticorpo Arp2/3 (Anti-p34-Arc/ARPC2, Millipore Sigma, 07-227) è stato usato a 1:100. L’anticorpo DAAM1 (Bethyl Laboratories, A300-078A) è stato usato a 1:100. L’anticorpo DIAPH1 (Sigma-Aldrich, HPA026605) è stato usato a 1:100. L’anticorpo della troponina T cardiaca (Santa Cruz Biotechnology, CT3, sc-20025) è stato utilizzato a 200 µg/ml. Gli anticorpi secondari sono stati diluiti al 10% di BSA a 1:100 e centrifugati a 13.000 rpm per 10 minuti prima dell’uso. Le cellule sono state riprese in VECTASHIELD Antifade Mounting Media con DAPI (H-1200, VECTOR LABORATORIES, Burlingame, CA, USA). Per etichettare sia NMIIA che NMIIB nello stesso campione (come nella Figura 7A), l’anticorpo primario NMIIA è stato etichettato direttamente usando un kit di etichettatura dell’anticorpo primario di Biotium (Mix-n-Stain CF Antibody Labeling Kits, Biotium, Inc. Fremont, CA). Seguendo il protocollo dei produttori, l’NMIIA è stato etichettato come anticorpo primario e la colorazione è stata confrontata visivamente con il protocollo standard di immunofluorescenza (vedi sopra) per convalidare il modello di localizzazione.

Analisi dei dati RNA-seq

Le letture RNA-seq sono state allineate al genoma umano di riferimento hg19 utilizzando STAR(Dobin et al., 2013) e quantificate da featureCounts(Liao et al., 2014). I conteggi delle letture sono stati normalizzati con il metodo Relative Log Expression (RLE) e i valori FPKM per ogni campione sono stati generati da DESeq2(Love et al., 2014).

Microscopia ad illuminazione strutturata

In questo studio sono stati utilizzati due microscopi SIM (gli esperimenti individuali sono stati sempre ripresi con lo stesso microscopio). L’imaging e l’elaborazione delle immagini SIM è stata effettuata su una GE Healthcare DeltaVision OMX equipaggiata con un obiettivo a olio 60×/1,42 NA e una telecamera sCMOS a temperatura ambiente. L’imaging e l’elaborazione delle immagini SIM è stata eseguita anche su una piattaforma di illuminazione strutturata Nikon N-SIM dotata di una telecamera EMCCD Andor DU-897 e di un obiettivo SR Apo TIRF (olio) 100 × 1,49 NA WD 0,12 a temperatura ambiente.

Microscopia a disco rotante

Le immagini confocali dei dischi rotanti sono state scattate su un disco rotante Nikon Spinning Disk equipaggiato con una testa a disco rotante Yokogawa CSU-X1, una fotocamera Andor DU-897 EMCCD e un obiettivo 100x Apo TIRF (olio) 1,49 NA WD 0,12 mm a 37 gradi C e 5%CO2.

Microscopia confocale a scansione laser

Le immagini confocali a scansione laser sono state scattate su un laser Nikon A1R dotato di un obiettivo 60x/1,40 Plan Apo Oil a 37 gradi C e 5%CO2. Le immagini confocali per laFigura 9C (in vivo, a destra) e la Figura 9-figuresupplement 1C-D sono state scattate su uno Zeiss 880 con AiryScan equipaggiato con un obiettivo Plan-Apochromat Oil 63x/1.40 a temperatura ambiente.

Microscopia ad ampio campo

Le immagini ad ampio campo sono state scattate su una Nikon Eclipse Ti ad alta risoluzione ad ampio campo equipaggiata con un obiettivo ad olio Nikon 100x Plan Apo 1.45 NA e una fotocamera CMOS Nikon DS-Qi2. I dati presentati inFigura 8-figure supplement 6 sono stati acquisiti su un sistema di Live-Cell Analysis di Essen Incucyte S3 (Ann Arbor, MI) con l’obiettivo 20x. Foto-conversione esperimenti sono stati eseguiti come descritto in precedenza(Fenix et al., 2016).

Quantificazione e analisi statistica

Quantificazione del montaggio del sarcomero

Per quantificare la percentuale di hiCM con sarcomeri (cioè.., Figura 4B), il citoscheletro di actina (tramite falloidina fluorescente etichettato) è stato ripreso con microscopia a illuminazione strutturata. hiCMs sono stati quantificati come contenenti strutture sarcomeri se contenevano almeno una miofibrilla contenente almeno 3 Z-dischi (colorazione falloidina brillante che si sovrappone con α-actinina 2 colorazione come in Figura 4A) distanziati ~ 1,5-2 micron di distanza. Con queste metriche la nostra quantificazione della formazione del sarcomero non è una misura della maturità o dell’allineamento del sarcomero, ma una misura della capacità degli hiCM di assemblare i blocchi di costruzione del sarcomero (cioè i sottili filamenti di actina) in risposta ad una perturbazione. Così, mentre gli hiCMs NMIIA KD formano chiaramente degli hiCMs non allineati, disorganizzati, e meno sarcomeri e miofibrille rispetto agli hiCMs di controllo, essi mantengono ancora la capacità di assemblare le strutture dei sarcomeri, che si riflette nella nostra quantificazione(Figura 8A e C). Nella stessa ottica, ci rendiamo conto che la nostra quantificazione è una quantificazione molto liberale dell’assemblaggio dei sarcomeri. Mentre non ci aspettiamo che una piccola serie di sarcomeri rappresenti un cardiomiocita funzionalmente capace, stiamo investigando i primi passi dell’assemblaggio dei sarcomeri e la capacità degli hiCM di formare la struttura di base dell’actina-miosina del sarcomero.

β miosina cardiaca II (βCMII) filamento e quantificazione della pila

Una metodologia simile è stata utilizzata per quantificare le pile di filamenti in banda A della βCMII utilizzando la colorazione endogena della βCMII e la SIM al posto del citoscheletro dell’actina. Un filamento βCMII è stato quantificato come la minima unità risolvibile SIM βCMII risolvibile che aveva un’organizzazione bipolare (un filamento con domini motori su ogni lato), come rappresentato nella Figura 11A. hiCMs sono stati quantificati come contenenti stack di filamenti in banda A βCMII se contenevano anche un solo stack di filamenti βCMII nella cella. Una pila di filamenti βCMII è stata definita come più spessa del filamento βCMII risolvibile minimo della SIM, indicando più filamenti βCMII risolvibili della SIM. Infatti, con questa metrica, le pile di filamenti βCMII hanno più “domini motori” risolvibili dei filamenti βCMII.

Per l’arco di actina e le velocità di flusso retrogrado MSF (come nella Figura 3), sono state utilizzate 3 regioni di interesse (ROI) per cella. ROI sono stati disegnati utilizzando lo strumento linea in FIJI a partire da davanti al bordo anteriore (per garantire la formazione di nuovi MSF è stato catturato) al corpo della cellula in cui sono state localizzate le strutture di sarcomeri. Le ROI sono state poi utilizzate per misurare i tassi di traslocazione di MSF utilizzando lo strumento chimografo (larghezza della linea = 3) su hiCM che erano stati allineati utilizzando la funzione StackReg. I chimografi generati in questo modo sono stati poi misurati manualmente contando i pixel sull’asse X (distanza) e sull’asse Y (tempo) per una misurazione della distanza/tempo che ha portato a tassi di traslocazione. Questo metodo è simile ai metodi precedentemente descritti per la traslocazione dell’arco di actina in cellule non muscolari.

Per misurare la distanza tra le strutture di α-actina 2, sono stati utilizzati lo strumento linea e lo strumento di misura in FIJI (Fiji is Just ImageJ). Le linee sono state disegnate, le posizioni registrate (utilizzando lo strumento ROI), e le distanze misurate tra α-acttinina 2 strutture. Sono state utilizzate più regioni per cella per α-actinina 2 in MSF, e celle intere per le distanze tra i sarcomeri.

Per misurare le dimensioni della linea Z in hiCMs, lo strumento di linea e strumento di misura in FIJI è stato utilizzato. Le linee sono state disegnate su singole linee Z e le loro posizioni sono state registrate utilizzando lo strumento ROI. Questo ha dato una misura delle dimensioni della linea Z e della posizione all’interno della cella. Per le misurazioni della linea Z, come la Figura 8E, sono state misurate tutte le linee Z che potevano essere misurate in modo affidabile.

Quantificazione della localizzazione in immunofluorescenza

Per quantificare la localizzazione di NMIIA, NMIIB e βCMII, per ogni cella sono state effettuate scansioni di linea a partire dal bordo della cella e le localizzazioni medie normalizzate sono state utilizzate per calcolare la media del numero di esperimenti indicati per i modelli di localizzazione finale rappresentati nel grafico (come nella Figura 7B).

Per quantificare l’intensità di Arp2/3, è stata adottata una strategia simile ma modificata. quattro scatole separate per ogni cella sono state posizionate lungo il bordo della cella (cioè il lamellipodio) utilizzando il canale di actina come guida. Queste scatole sono state poi utilizzate per misurare l’intensità media del canale anti-p34 (cioè il complesso Arp2/3). Sfondo sottratto medie per ogni cellula in controllo e CK666 hiCM trattati sono stati utilizzati per quantificare la diminuzione percentuale come illustrato nella figura 4F.

Cellule utilizzate per questo studio

Per avere risultati comparabili, le cellule utilizzate per questo studio sono state standardizzate in base alla morfologia. In particolare, le cellule non muscolari diffuse e le hiCM con un ampio bordo d’attacco e la lamella sono state scelte come precedentemente mostrato negli studi sulla formazione del sistema contrattile sia non-muscolare che muscolare(Burnette et al., 2014; Rhee et al., 1994). Questo ha anche facilitato la capacità di osservare la MSF per la transizione del sarcomero in hiCMs vivo, ed è raccomandato per studi futuri che indagano l’assemblaggio del sarcomero. Tutti gli esperimenti di misurazione dell’assemblaggio dei sarcomeri sono stati condotti almeno 3 volte, separatamente, e le cellule sono state riprese utilizzando la SIM. Anche se questo si traduce in un numero relativamente piccolo di cellule per alcuni degli esperimenti, crediamo che le modalità di imaging a super-risoluzione come la SIM offrono una visione inestimabile sull’assemblaggio dei sarcomeri(Gustafsson, 2005). Infatti, l’imaging a subdiffrazione è necessario per localizzare in modo affidabile i co-filamenti di miosina II sia in vitro che in vivo. Inoltre, come si è visto in Drosophila, anche le modalità di imaging ad alta risoluzione come la microscopia confocale a scansione laser non sono sufficienti per rilevare sottili, ma importanti, cambiamenti strutturali in risposta alle perturbazioni(Fernandes e Schöck, 2014).

Statistiche

La significatività statistica è stata calcolata utilizzando i test T-test degli studenti a due code e non accoppiati eseguiti in Excel. Tutti gli esperimenti indipendenti rappresentano repliche biologiche. Le barre di errore in tutti i grafici rappresentano l’errore standard della media (SEM). Per tutti i grafici che rappresentano la % di celle (ad esempio, Figura 1D), il numero di celle e di esperimenti è indicato nella legenda delle figure. Le percentuali visualizzate rappresentano la media delle medie di tutti gli esperimenti eseguiti. Ad esempio, se le celle di controllo mostrano il 95%, 90% e 100% di tutte le celle che mostrano gli archi di actina in tre esperimenti separati, la percentuale rappresentata nel grafico sarebbe del 95%. Il SEM è stato calcolato dividendo la deviazione standard per la radice quadrata del numero di esperimenti separati. Per i tassi di traslocazione dell’actina sono state utilizzate almeno tre misurazioni per cella per calcolare i tassi medi di traslocazione per cella. I tassi di traslocazione sono stati poi calcolati nello stesso modo descritto sopra. I grafici a scansione di linea rappresentano la fluorescenza relativa normalizzata.

References

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Fonte

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