Analisi spaziale e temporale della dinamica della proteina PCP durante la chiusura del tubo neurale

Abstract

La polarità delle cellule planari (PCP) controlla l'estensione convergente e l'allungamento dell'asse in tutti i vertebrati. Anche se la localizzazione asimmetrica delle proteine PCP è fondamentale per la loro funzione, si capisce poco della localizzazione della proteina PCP durante l'estensione convergente. Qui, usiamo l'imaging quantitativo dal vivo per monitorare contemporaneamente i comportamenti di intercalazione delle cellule e le dinamiche della proteina PCP nell'epitelio della placca neurale di Xenopus laevis. Abbiamo osservato l'arricchimento asimmetrico delle proteine PCP, ma più interessante, abbiamo osservato una stretta correlazione tra l'arricchimento della proteina PCP e il comportamento contrattile actomiosino-driven delle giunzioni cellula-cellula. Inoltre, abbiamo trovato che i tassi di turnover delle proteine PCP giunzionali sono anche correlati con il comportamento contrattile delle giunzioni individuali. Tutte queste relazioni dinamiche sono state interrotte quando la segnalazione del PCP è stata manipolata. Insieme, questi risultati forniscono una visione dinamica e quantitativa della localizzazione della proteina PCP durante l'estensione convergente e suggeriscono un legame complesso e intimo tra la localizzazione dinamica delle proteine PCP del nucleo, l'assemblaggio dell'actomiosina e il restringimento della giunzione polarizzata durante l'intercalazione cellulare nel tubo neurale vertebrato di chiusura.

Introduzione

L’estensione convergente (CE) è il motore morfogenetico evolutivo conservato che guida l’allungamento dell’asse corporeo negli animali che vanno dagli insetti ai mammiferi (Tada e Heisenberg, 2012). Comportamenti cellulari multipli possono contribuire a CE, ma il processo di gran lunga più ben compreso è l’intercalazione cellulare, con la quale le cellule si riorganizzano in modo polarizzato (Walck-Shannon e Hardin, 2014). L’intercalazione cellulare, a sua volta, si pensa che sia guidata da molteplici comportamenti subcellulari, tra cui l’estensione delle protrusioni cellulari mediolateralmente dirette (ad esempio [Keller e Hardin , 1987; Shih e Keller, 1992]) e il restringimento attivo delle giunzioni cellula-cellula mediolateralmente orientate (ad esempio [Bertet et al., 2004; Blankenship et al., 2006]). Dati più recenti suggeriscono che questi due comportamenti subcellulari probabilmente lavorano in concerto (Sun et al., 2017; Williams et al., 2014). La comprensione dei meccanismi molecolari che regolano l’attività protrusiva e la contrazione della giunzione durante l’intercalazione cellulare sarà essenziale per comprendere l’estensione convergente.

Il meccanismo di contrazione della giunzione per l’intercalazione cellulare è stato inizialmente descritto in Drosophila (Bertet et al., 2004; Blankenship et al., 2006) ed è stato successivamente identificato in entrambe le cellule epiteliali e mesenchimali nei vertebrati (Lienkamp et al., 2012; Nishimura et al., 2012; Shindo e Wallingford, 2014; Trichas et al., 2012; Williams et al., 2014). In tutti i tessuti esaminati per immagini dal vivo, la contrazione delle giunzioni è accompagnata da contrazioni di actomiosina pulsata che sono limitate o arricchite a giunzioni cellulari orientate mediolateralmente e assenti o meno comuni alle giunzioni perpendicolari all’asse anteriore-posteriore (Bertet et al., 2004; Blankenship et al., 2006; Shindo e Wallingford, 2014; Williams et al., 2014). Un’importante questione irrisolta riguarda il meccanismo molecolare attraverso il quale l’attività dell’actomiosina è limitata a specifiche giunzioni cellula-cellula durante l’intercalazione.

In Drosophila, i geni di coppia e i recettori di pedaggio sono regolatori cruciali dell’actomiosina polarizzata (Paré et al., 2014; Zallen e Wieschaus, 2004), ma i geni omologhi non sembrano essere coinvolti nei vertebrati. Invece, il regolatore più ben caratterizzato dell’intercalazione cellulare mediolaterale nei vertebrati è il sistema di segnalazione della polarità delle cellule planari (PCP) (Butler e Wallingford, 2017). Infatti, la segnalazione PCP controlla l’intercalazione cellulare durante la gastrulazione e la chiusura del tubo neurale in rane, pesci e topi, e le mutazioni nei geni PCP sono ora un fattore di rischio genetico ben definito per i difetti di nascita del tubo neurale umano (NTDs) (De Marco et al., 2014; Juriloff e Harris, 2012; Wallingford et al., 2013). La comprensione della segnalazione del PCP è quindi una sfida critica nella biologia cellulare dello sviluppo.

Un principio fondamentale della segnalazione PCP è che la polarità delle cellule è impartita dall’arricchimento asimmetrico delle proteine del nucleo PCP (Butler e Wallingford, 2017; Strutt e Strutt, 2009). Come mostrato per la prima volta in Drosophila, le proteine Prickle (Pk) e Van Gogh (Vangl) agiscono in concerto su un lato della cellula, e Dishevelled e Frizzled agiscono sul lato complementare (Axelrod, 2001; Bastock et al., 2003; Strutt, 2001; Tree et al., 2002). È interessante notare che gli studi FRAP in Drosophila hanno dimostrato che questi modelli di arricchimento sono guidati dalla polarizzazione planare della cinetica di rotazione giunzionale delle proteine PCP, sottolineando la natura dinamica del sistema di segnalazione del PCP (Strutt et al., 2011). Simili modelli di arricchimento e di turnover sono stati riportati in epiteli vertebrati (Butler e Wallingford, 2015; Chien et al., 2015; Shi et al., 2016), ma meno si sa sulla dinamica di localizzazione della proteina PCP durante l’intercalazione cellulare.

Ad esempio, i domini complementari e asimmetrici dell’arricchimento della proteina PCP sono stati descritti durante il vertebrato CE (Ciruna et al., 2006; Jiang et al., 2005; McGreevy et al., 2015; Ossipova et al., 2015; Roszko et al., 2015; Yin et al., 2008), ma come l’arricchimento della proteina PCP sia coordinato nello spazio e nel tempo con i comportamenti subcellulari che guidano l’intercalazione rimane essenzialmente inesplorato. Questa lacuna nelle nostre conoscenze è critica, perché lavori recenti dimostrano che le proteine PCP sono necessarie per i comportamenti di contrazione della giunzione che contribuiscono in modo critico all’intercalazione cellulare (Lienkamp et al., 2012; Nishimura et al., 2012; Shindo e Wallingford, 2014). Quindi, c’è un urgente bisogno di un quadro quantitativo e dinamico della localizzazione della proteina PCP in quanto si riferisce sia ai comportamenti subcellulari coinvolti nell’intercalazione cellulare che al macchinario dell’actomiosina che li guida.

A tal fine, abbiamo stabilito metodi per la quantificazione robusta della localizzazione della proteina PCP in una placca neurale di vertebrati viventi, nonché metodi per correlare la dinamica della proteina PCP con i comportamenti subcellulari che guidano l’intercalazione delle cellule epiteliali. Sorprendentemente, troviamo che, oltre ai modelli previsti di asimmetria spaziale, l’arricchimento della proteina PCP è strettamente legato al comportamento della giunzione cellula-cellula: Prickle2 (Pk2) e Vangl2 sono stati dinamicamente arricchiti in modo specifico a restringere le giunzioni cellula-cellula e impoverito da giunzioni allungate durante l’intercalazione cellulare. L’analisi FRAP ha rivelato che questi modelli di arricchimento rifletteva le differenze nella cinetica del turnover proteico in questi siti. Inoltre, l’arricchimento Pk2 era temporalmente e spazialmente correlato con le oscillazioni planari polarizzate di arricchimento actomiosinico giunzionale. È importante notare che tutte queste relazioni dinamiche sono state interrotte quando la segnalazione PCP è stata manipolata. Così, i nostri studi rivelano un intimo legame tra la localizzazione dinamica delle proteine del nucleo PCP, l’assemblaggio di actomiosina, e la contrazione della giunzione polarizzata durante l’intercalazione cellulare del tubo neurale vertebrato di chiusura.

Risultati

Abbiamo caratterizzato la dinamica della proteina PCP nella piastra neurale di Xenopus, come gli studi in questo animale prefigurano costantemente risultati simili in sistemi di mammiferi, ma forniscono una visione eccezionale dei processi biologici cellulari dinamici. Poiché la funzione scompigliata e frizzante sia nella segnalazione PCP che in quella canonica Wnt, i loro ruoli sono più difficili da interrogare, ci siamo concentrati invece su Prickle e Vangl, che agiscono esclusivamente nella segnalazione PCP e sono necessari per la chiusura del CE e del tubo neurale nei vertebrati, incluso lo Xenopus (Darken et al., 2002; Goto et al., 2005; Goto e Keller, 2002; Kibar et al., 2001; Takeuchi et al., 2003). I lavori precedenti suggeriscono che Prickle e Vangl si localizzano sulla faccia anteriore delle cellule della placca neurale di Xenopus (Ossipova et al., 2015), ma abbiamo cercato di stabilire una quantificazione più robusta di questo modello come base per gli studi time-lapse descritti di seguito.

Abbiamo usato l’iniezione di mRNA per esprimere le fusioni della proteina fluorescente (FP) alle proteine PCP nello Xenopus. Poiché la sovraespressione delle proteine PCP ha un effetto ben documentato sulla segnalazione PCP, abbiamo usato esperimenti di titolazione per determinare empiricamente la più bassa dose possibile di mRNA che ha permesso l’imaging nella piastra neurale di Xenopus. In queste condizioni, GFP-Vangl2 ha mostrato una forte polarizzazione asimmetrica alle facce delle cellule anteriori (Figura 1A), mentre a dosi leggermente più elevate di mRNA iniettato, bassi livelli di Vangl2 potrebbe essere osservato alle facce posteriori pure (non mostrato), coerente con i rapporti precedenti (Ossipova et al., 2015; Roszko et al., 2015). Le proteine del nucleo PCP sono codificate da famiglie multigene, e nonostante il ruolo riportato di Prickle1 nell’estensione convergente, GFP-Pk1 non ha mostrato un arricchimento asimmetrico nelle nostre mani (non mostrato). Tuttavia, GFP-Prickle2 (Butler e Wallingford, 2015) è stato fortemente arricchito anteriormente (Figura 1A). GFP-Pk2 è stato anche limitato alle regioni giunzionali delle cellule apicolaterali, come previsto (Figura 1-figure supplement 1). Esperimenti Knockdown ha confermato che Pk2 era fisiologicamente rilevante per l’estensione convergente e la chiusura del tubo neurale in Xenopus (Figura 1-figure supplemento 2). Negli esperimenti di doppia etichettatura, GFP-Vangl2 fortemente co-localizzato con RFP-Pk2 (Figura 1A, Video 1).

Abbiamo quantificato questi modelli di localizzazione a livello di popolazione, raggruppando le giunzioni cellula-cellula in due gruppi in base al loro orientamento. Per mantenere una nomenclatura coerente con il lavoro precedente sull’intercalazione cellulare, ci riferiamo a giunzioni allineate entro 45 gradi dell’asse mediolaterale come ‘giunzioni a V’ e le giunzioni perpendicolari (tra 45 e 90 gradi fuori dall’asse mediolaterale) come ‘giunzioni a T’. Un’importante sottigliezza da notare qui è che le giunzioni a V sono mediolateralmente allineate, ma in realtà separano le cellule che sono vicine anteroposteriori. Abbiamo trovato che GFP-Pk2 è stato significativamente arricchito a V-giunzioni rispetto a T-giunzioni (Figura 1B). In una visione più granulare dei dati, abbiamo osservato una correlazione significativa tra l’intensità dei pixel GFP-Pk2 e l’angolo di giunzione, con un maggiore arricchimento lungo giunzioni più mediolateralmente orientate (Figura 1C).

Per testare questi schemi di quantificazione, abbiamo approfittato del fatto che in molti altri sistemi, l’interruzione di una qualsiasi proteina PCP del nucleo porta alla perdita di arricchimento polarizzato degli altri. Abbiamo usato l’iniezione mirata per coesprimere i reagenti per l’interruzione della segnalazione del PCP insieme ad un tracciante di lignaggio RFP nucleare, permettendoci di confrontare le cellule normali e quelle sperimentali nello stesso embrione (Figura 1D,E). Xdd1 è un ben definito, PCP-specifico negativo dominante di Dvl2 (Sokol, 1996; Wallingford et al., 2000) che perturba l’estensione convergente del tubo neurale in Xenopus (Wallingford e Harland , 2001; Wallingford e Harland, 2002); abbiamo trovato che Xdd1 espressione gravemente perturbato asimmetrie Prickle2 asimmetrie nella piastra neurale utilizzando sia ensemble e metriche individuali (Figura 1B,C).

Per estendere questa analisi, abbiamo esplorato la segnalazione Pk2 esprimendo un costrutto di cancellazione privo dei domini PET e LIM (Pk2-ΔPΔL), in quanto questo costrutto ha interrotto il PCP nelle cellule multiciliate di Xenopus e una cancellazione equivalente di Pk1 interrompe il CE (Butler e Wallingford, 2015; Takeuchi et al., 2003). Abbiamo trovato che Pk2-ΔPΔL fortemente perturbato l’allungamento dell’asse in Xenopus (Figura 1-figure supplement 3) e anche gravemente perturbato l’asimmetria planare di co-espresso wild-type Pk2-GFP nella piastra neurale (Figura 1B,C). Questi risultati stabiliscono la piastra neurale di Xenopus come una piattaforma efficace e quantitativa per gli studi di localizzazione della proteina PCP.

Estensione epiteliale convergente nella chiusura del tubo neurale di Xenopus Xenopus comporta la contrazione della giunzione polarizzata dipendente dal PCP

L’estensione convergente è un processo intrinsecamente dinamico, in quanto le cellule si scambiano costantemente i vicini. La natura dinamica dei tessuti impegnati nell’estensione convergente differisce notevolmente dalle impostazioni in cui la localizzazione della proteina PCP è più comunemente studiata. Abbiamo quindi cercato di sfruttare i punti di forza degli embrioni di Xenopus per la dinamica della proteina PCP immagine insieme con i comportamenti subcellulari che guidano l’estensione convergente nel tubo neurale di chiusura. Curiosamente, la piastra neurale di Xenopus è costituito da due strati cellulari, uno strato epiteliale esterno e uno strato mesenchimale più profondo (Schroeder, 1970). Mentre l’intercalazione cellulare delle cellule mesenchimali profonde è stato caratterizzato (Elul et al., 1997; Keller et al., 1992), i comportamenti delle cellule epiteliali sovrastanti non hanno. Questa distinzione non è banale, perché sono le cellule epiteliali esterne che mostrano i modelli robusti di localizzazione della proteina PCP descritti sopra. Per capire come la localizzazione della proteina PCP si riferisce ai comportamenti convergenti delle cellule di estensione, abbiamo dovuto prima di tutto caratterizzare i comportamenti delle cellule in questo epitelio.

La chiusura del tubo neurale si estende per circa 6 ore in Xenopus, a partire dalla modellazione del tubo neurale in fase di ultima gastrula, seguita dalla progressiva elevazione e l’applicazione delle pieghe neurali (Figura 2A). Abbiamo immobilizzato gli embrioni in uno stadio di microscopio confocale (Kieserman et al., 2010) e abbiamo usato la piastrellatura delle immagini per raccogliere immagini ad alta ingrandimento della piastra neurale superficiale attraverso l’intera chiusura del tubo neurale (Video 2). Questo approccio ha permesso di valutare i cambiamenti morfogenetici a livello tissutale nella placca neurale, così come le traiettorie delle singole cellule, che assomigliavano molto a quelle degli studi precedenti ((Figura 2B; Figura 2-figure supplement 1) e vedi [Keller et al., 1992]). Inoltre, il nostro approccio di piastrellatura ha fornito un ingrandimento sufficiente a quantificare i comportamenti discreti delle singole cellule, e il tracciamento dei cluster di cellule ha rivelato ampie intercalazioni che erano mediolateralmente di parte, con conseguente convergenza ed estensione (Figura 2C, Video 3).

Intercalazioni cellulari nella piastra neurale sono stati associati con le cosiddette transizioni T, che sono caratterizzati da contrazione preferenziale di giunzioni allineate nell’asse mediolaterale (T1-T2 transizione) (Figura 3A, a” ), seguita da allungamento di nuove giunzioni perpendicolarmente lungo l’asse anteroposteriore (T2-T3 transizione) (Figura 3a‘, a”’ ) (Bertet et al., 2004). Come sopra, abbiamo prima quantificato questi comportamenti a livello di insieme e abbiamo trovato che mediolateralmente orientato V-giunzioni orientate preferibilmente si è ridotto, mentre la perpendicolare T-giunzioni allungata (Figura 3B). Inoltre, quando abbiamo tracciato la variazione della lunghezza delle giunzioni cellula-cellula contro l’angolo medio di tale giunzione per tutte le cellule esaminate (n > 250), abbiamo osservato una correlazione significativamente positiva; le giunzioni a V si sono preferibilmente ristrette lungo l’asse mediolaterale e le giunzioni a T allungate perpendicolarmente (Figura 3C). È importante notare che l’orientamento delle giunzioni che si restringono e crescono in questa analisi è rimasto abbastanza costante, cambiando in media solo 5 (±4) gradi nel corso della misurazione, e nessuna giunzione spostata di più di 20 gradi. Così, in generale, le giunzioni a V separano i vicini anteroposteriori (AP) e le giunzioni a T separano i mediolaterali (ML). Infine, abbiamo anche osservato la formazione planare polarizzata e la risoluzione delle rosette multicellulari (Figura 3D-F), come sono stati descritti in altri epiteli (Blankenship et al., 2006; Lienkamp et al., 2012; Trichas et al., 2012).

Poiché la segnalazione PCP è essenziale per l’estensione neurale convergente, abbiamo poi valutato l’effetto di interruzione PCP in particolare sui comportamenti di contrazione della giunzione nel epitelio neurale. Utilizzando l’approccio a mosaico descritto sopra, abbiamo trovato che l’espressione di Xdd1 ha suscitato il difetto previsto a livello tissutale nel movimento medialmente diretto delle pieghe neurali (Figura 4A, nuclei magenta indicano Xdd1 che esprime le cellule).

L’analisi dei comportamenti delle singole cellule in questi embrioni ha rivelato che l’espressione Xdd1 ha significativamente interrotto la contrazione della giunzione planare polarizzata, eliminando la forte correlazione tra l’angolo di giunzione e la contrazione o la crescita della giunzione (Figura 4B, confrontare con la Figura 3C). Questo disaccoppiamento del comportamento della giunzione dall’orientamento è stato associato ad una riduzione del restringimento della giunzione in generale e ad una riduzione del numero di transizioni T produttive (Figura 4C). Infatti, anche le poche transizioni T produttive che sono state osservate sono state significativamente rallentate (Figura 4D).

Infine, questi difetti nel comportamento di intercalazione delle cellule hanno avuto un profondo impatto sulla forma delle cellule. Durante le fasi di placca neurale shaping (12-14), la maggior parte delle cellule epiteliali neurali negli embrioni di controllo ha mostrato uno spostamento da un orientamento anteroposteriore ad un orientamento mediolaterale (Figura 4E, verde), mentre Xdd1 che esprime le cellule mantengono il loro allineamento nell’asse anteroposteriore (Figura 4E, blu). In realtà, queste cellule in realtà aumentato il loro rapporto lunghezza-larghezza lungo l’asse AP (non mostrato), probabilmente come risultato di forze generate da altri comportamenti cellulari che formano la piastra neurale in queste fasi (ad esempio costrizione apicale, allungamento del mesoderma sottostante, ecc.) In particolare, la mutazione genetica dei geni PCP nei pesci zebra provoca anche uno spettro simile di difetti di forma e di orientamento delle cellule (Roszko et al., 2015). Infine, l’interruzione della funzione Prickle per espressione del dominante-negativo Pk2-ΔPΔL ha suscitato lo stesso spettro di difetti (Figura 4C,D, rosa; Figura 4-figure supplemento 1). Insieme ai nostri dati sulla localizzazione della proteina PCP (Figura 1, sopra), questi risultati stabiliscono la placca neurale di Xenopus come una piattaforma efficace con cui sondare la relazione tra i comportamenti di intercalazione delle cellule epiteliali e la dinamica della proteina PCP del nucleo.

Prickle2 e Vangl2 sono dinamicamente arricchiti in modo specifico a restringere le giunzioni cellula-cellula

Con questi sistemi di imaging e di analisi, abbiamo eseguito l’imaging time-lapse con un occhio di riguardo alla comprensione della relazione dinamica tra la localizzazione della proteina PCP e i comportamenti delle cellule epiteliali. Questa analisi ha rivelato diverse nuove intuizioni. In primo luogo, abbiamo notato che l’accumulo di Pk2 è stato giunzione specifica, visualizzando cambiamenti evidenti di intensità proprio a giunzioni tricellulari (Figura 5A). Inoltre, abbiamo trovato che GFP-Pk2 è stato dinamicamente arricchito a giunzioni contrazione, ma impoverito da giunzioni allungamento (Figura 5A), suggerendo che l’arricchimento dinamico di Pk2 potrebbe non riflettere semplicemente l’orientamento spaziale della giunzione (ad esempio a V- vs T-giunzioni). Questa nozione è stata supportata dall’osservazione che anche quando le giunzioni adiacenti condividono un orientamento simile, l’intensità GFP-Pk2 a queste giunzioni spesso differivano sostanzialmente (Video 4 e 5). Per esempio, le immagini fisse della Figura 5B mostrano tre giunzioni adiacenti che condividono un allineamento mediolaterale approssimativamente simile; nessuna si discosta di più di 20 gradi dal mediolaterale in qualsiasi punto del filmato. Tuttavia, due delle giunzioni si restringono durante il filmato (parentesi rosse) mentre la terza cresce (parentesi gialle). Anche tra queste giunzioni orientate in modo simile, la contrazione è associata a livelli crescenti di intensità Pk2-GFP, e l’allungamento con Pk2-GFP decrescente (Figura 5C). Risultati simili sono stati ottenuti per Vangl2 (Figura 5-figure supplement 1).

Per quantificare queste osservazioni, abbiamo tracciato le variazioni di intensità di fluorescenza GFP-Pk2 contro le corrispondenti variazioni di lunghezza delle giunzioni e abbiamo osservato una forte e significativa correlazione (Figura 6A). Risultati simili sono stati osservati con Vangl2 (Figura 6B). Abbiamo considerato la possibilità che questi cambiamenti di intensità potrebbero riflettere la densità, aumentando semplicemente se la quantità di proteine su una giunzione rimane costante come tale giunzione si riduce. Per esplorare questa idea, abbiamo esaminato un marcatore generico di membrana (FP-caax) e abbiamo trovato che, mentre ha mostrato una tendenza ad aumentare come le giunzioni si restringono, questo aumento è stato modesto e la correlazione era molto più debole di quella osservata per le proteine PCP (Figura 6C). È importante notare che, anche quando normalizzato contro il marcatore di membrana per tener conto dei cambiamenti della membrana-PFP nelle stesse giunzioni, le intensità di GFP-Vangl2 e GFP-Prickle2 mostravano ancora forti e significative correlazioni con il restringimento delle giunzioni (Figura 6-figure supplement 1).

Questi risultati suggeriscono che la forza di arricchimento asimmetrico Pk2 e Vangl2 arricchimento in una particolare giunzione è almeno altrettanto fortemente legato al comportamento dinamico di quella giunzione come lo è per l’orientamento della giunzione. Come test finale di questa idea, abbiamo selezionato un sottoinsieme di giunzioni a V che sono rimaste allineate entro 30 gradi dell’asse ML per l’intero filmato e poi abbiamo tracciato la velocità media di contrazione o crescita contro l’intensità media di GFP-Pk2 a quella giunzione. Anche in questo caso, abbiamo trovato una correlazione altamente significativa (Figura 6-figure supplement 2). Insieme, questi dati suggeriscono che l’arricchimento di Pk2 e Vangl2 è governato sia dall’interazione reciproca di ogni singola coppia di cellule vicine, sia dal comportamento della giunzione condivisa tra di loro.

Fatturato di Prickle2 e Vangl2 a giunzioni cellula-cellula è planare polarizzata durante l’intercalazione cellulare

Della dinamica della proteina PCP che abbiamo osservato, abbiamo ritenuto che l’arricchimento specifico alle giunzioni a V in contrazione fosse il più significativo. I nostri dati con Caax-GFP (Figura 6C) suggeriscono che la semplice riduzione della lunghezza della giunzione non è sufficiente per aumentare la densità nella misura massima osservata per Pk2 e Vangl2 a giunzioni che si restringono. Abbiamo ragionato, quindi, che l’arricchimento del PCP potrebbe anche comportare un processo attivo, ad esempio in cui la cinetica di rotazione regolata è più dinamica in alcuni nodi e meno in altri. Gli studi FRAP hanno dimostrato che il turnover della proteina PCP polarizzata è polarizzato in modo planare in altri tipi di cellule (Butler e Wallingford, 2015; Chien et al., 2015; Shi et al., 2016; Strutt et al., 2011), quindi abbiamo utilizzato questo metodo per valutare le dinamiche di localizzazione durante l’intercalazione cellulare nel tubo neurale di chiusura (Figura 7A).

Sia Pk2 che Vangl2 hanno mostrato notevoli differenze nella cinetica del fatturato a giunzioni in contrazione rispetto a quelle non in contrazione, con un recupero significativamente minore (cioè una frazione stabile più alta) sia per Vangl2 che per Prickle2 a giunzioni in contrazione rispetto a quelle non in contrazione (Figura 7B,C). Inoltre, quando abbiamo integrato questi dati FRAP con l’analisi del time-lapse dei comportamenti cellulari, abbiamo trovato che la frazione stabile di entrambe le proteine era correlata in modo significativo con le variazioni della lunghezza della giunzione: le giunzioni a contrazione più rapida mostravano frazioni stabili più elevate di proteine PCP giunzionali (Figura 7D,E). Quindi, l’accumulo complessivo di Prickle2 e Vangl2 alle giunzioni di contrazione è parallelo alla maggiore stabilità di queste proteine in questi siti e, insieme, questi dati suggeriscono un ruolo chiave per il traffico della proteina PCP nel coordinamento della contrazione della giunzione cellula-cellula.

La polarizzazione planare dell’actomiosina durante la contrazione della giunzione nell’epitelio neurale è dipendente dal PCP

Abbiamo poi cercato di capire il legame tra la localizzazione della proteina PCP e il macchinario dell’actomiosina noto per guidare il restringimento della giunzione cellula-cellula. Time-lapse imaging in Drosophila ha dimostrato per la prima volta che l’intercalazione cellulare da contrazione della giunzione è accompagnata da accumuli pulsati di actomiosina alle giunzioni a V (Bertet et al., 2004; Fernandez-Gonzalez et al., 2009; Rauzi et al., 2008). Mentre questo processo è indipendente dalla segnalazione di PCP in Drosophila, simili impulsi di actomiosina sono stati osservati durante la contrazione della giunzione dipendente dal PCP nelle cellule mesenchimali dello Xenopus gastrula mesoderm (Shindo e Wallingford, 2014). Le analisi statiche di Xenopus, pulcini e topi indicano anche che l’actomiosina si arricchisce alle giunzioni orientate mediolateralmente (McGreevy et al., 2015; Nishimura et al., 2012; Williams et al., 2014). Tuttavia, la relazione spazio-temporale tra la dinamica dell’actomiosina e i comportamenti subcellulari durante l’intercalazione cellulare nel tubo neurale vertebrato rimane poco definita.

Utilizzando un GFP-fusion alla catena luminosa regolatrice della miosina Myl9 (Shindo e Wallingford, 2014), abbiamo osservato un forte arricchimento alle giunzioni a V rispetto alle giunzioni a T. Questo arricchimento è stato evidente sia a livello di popolazione (Figura 8A-C, verde) sia nella significativa correlazione tra l’intensità del Myl9 e l’angolo di giunzione per le singole giunzioni (Figura 8D, verde, n > 450). Coerentemente con i rapporti precedenti in altri sistemi (Bertet et al., 2004; Shindo e Wallingford, 2014), l’intensità del Myl9 è stata elevata nelle giunzioni che si restringono (Figura 8-figure supplement 1A). Queste correlazioni sono probabilmente rilevanti dal punto di vista funzionale, perché i cambiamenti nell’arricchimento della miosina sono fortemente correlati con la diminuzione della lunghezza delle giunzioni. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando il biosensore dell’actina Utrophin-RFP (Burkel et al., 2007), e le variazioni di intensità della miosina sono stati anche fortemente correlati ai cambiamenti di actina sulle singole giunzioni (Figura 8-figure supplement 1).

L’espressione di Xdd1 o Pk2-ΔPΔL ha perturbato significativamente la polarizzazione planare dell’arricchimento miosinico (Figura 8A-D). È interessante notare che questi reagenti sembrano agire attraverso meccanismi di conversione: L’espressione di Xdd1 ha provocato un innalzamento dei livelli di miosina alle giunzioni a T, mentre l’espressione di Pk2-ΔPΔL ha provocato una riduzione dell’arricchimento della miosina alle giunzioni a V (Figura 8C). Questo risultato è stato sorprendentemente simile alla tendenza osservata sopra per le intensità GFP-Pk2 in queste condizioni (Figura 1B), suggerendo inoltre che gli arricchimenti di PCP e Myl9 sono funzionalmente correlati. Così, l’interruzione della segnalazione di PCP disturba sia la localizzazione asimmetrica della proteina PCP e la polarizzazione planare della contrazione dell’actomiosina nel tubo neurale di chiusura.

Le proteine PCP e la dinamica dell’actomiosina sono coordinate spazio-temporalmente con il restringimento delle giunzioni

Alla luce dei modelli spazio-temporali osservati della localizzazione della proteina PCP (Figura 8), abbiamo esaminato più da vicino la localizzazione di Myl9 e Pk2 durante i film time-lapse. Come ci si aspettava dai risultati ottenuti in altri sistemi, il Myl9-GFP mostrava un comportamento pulsatile alle giunzioni a V in contrazione (Figura 9A-B, Video 6). Myl9 ha anche pulsato alle giunzioni a T, anche se tali impulsi tendevano a comportare fluttuazioni più ampie e non sono riusciti a restringere la giunzione in modo persistente (Figura 9C). Sorprendentemente, intensità Pk2 visualizzato anche l’arricchimento pulsatile arricchimento, e inoltre, i cambiamenti in Pk2 sono stati fortemente correlati con simili cambiamenti di intensità Myl9 alle giunzioni cellula-cellula (Figura 9A-D). Infine, gli impulsi di Pk2 e Myl9 sono stati anche fortemente cross-correlati nel tempo (Figura 9E). Insieme, questi dati dimostrano modelli dinamici condivisi di proteine PCP nucleo e la localizzazione actomiosina nello spazio e nel tempo durante l’intercalazione cellulare e suggeriscono che questi sistemi lavorano in stretto concerto per guidare contrazione giunzione di guida nel epitelio neurale Xenopus epitelio.

Discussione

Qui, abbiamo usato la piastrellatura delle immagini e la microscopia time-lapse negli embrioni di Xenopus per generare filmati ad alto ingrandimento del tubo neurale del vertebrato in chiusura. Questi filmati ci hanno permesso di quantificare la localizzazione e la dinamica della proteina del nucleo PCP in relazione ai comportamenti cellulari associati all’estensione convergente. Ci concentriamo qui sulla contrazione della giunzione, che insieme alle sporgenze mediolaterali è un comportamento subcellulare essenziale che contribuisce all’intercalazione cellulare. Troviamo che il Prickle2 e Vangl2 mostrano un modello coerente di localizzazione e di rotazione nello spazio e nel tempo durante l’intercalazione cellulare che è fortemente legato all’assemblaggio di actomiosina alle giunzioni cellula-cellula. Per comprendere appieno le relazioni qui riportate saranno necessari studi meccanicistici diretti, ma i nostri dati sono comunque significativi per fornire una visione completa e quantitativa dei modelli spaziali e temporali della localizzazione della proteina PCP durante i movimenti collettivi delle cellule vertebrate.

Localizzazione della proteina PCP nel tempo e nello spazio durante l’estensione convergente

L’asimmetria spaziale delle proteine del nucleo PCP è fondamentale per la loro funzione. In una vasta gamma di tipi di cellule, la polarizzazione planare è definita da Dvl e Frizzled arricchimento ad una regione della cellula e Vangl e Prickle in un modello reciproco. Il feedback attraverso le membrane cellulari è pensato per rinforzare l’asimmetria inizialmente debole, portando alla robusta asimmetria nelle fasi successive (Butler e Wallingford, 2017; Strutt e Strutt, 2009).

È interessante notare che, mentre l’intercalazione cellulare è stata la prima impostazione in cui è stato definito il PCP dei vertebrati, i primi rapporti di localizzazione asimmetrica della proteina nei vertebrati sono venuti invece da studi sulle cellule ciliate del nodo e delle vie aeree (Rida e Chen, 2009; Wallingford, 2010). In effetti, ancora oggi sappiamo poco dei modelli spaziali e quasi nulla dei modelli temporali della localizzazione della proteina PCP nel contesto dell’estensione convergente.

Attualmente, è emerso un consenso sul fatto che le proteine PCP delineano spazialmente un asse anteriore-posteriore nelle cellule che subiscono l’intercalazione cellulare. Questo consenso è supportato da studi su varie proteine PCP in diversi tessuti, prima nel pesce zebra e successivamente in altri animali (Ciruna et al., 2006; McGreevy et al., 2015; Nishimura et al., 2012; Ossipova et al., 2015; Roszko et al., 2015; Yin et al., 2008). Questo modello è coerente con l’analogo modello di localizzazione anteroposteriore per le proteine PCP nell’orientamento del battito ciliare direzionale nel nodo embrionale e nel midollo spinale (Antic et al., 2010; Borovina et al., 2010; Hashimoto et al., 2010). Inoltre, questo asse di polarizzazione è coerente con i dati embriologici che suggeriscono che il patterning anteroposteriore è cruciale per l’estensione convergente in Xenopus (Ninomiya et al., 2004). Tuttavia, va notato che diversi studi suggeriscono ulteriori regioni di localizzazione nelle estremità mediolaterali delle cellule durante l’intercalazione cellulare (ad esempio [Jiang et al., 2005; Kinoshita et al., 2003; Panousopoulou et al., 2013]).

I nostri dati qui sono coerenti con l’idea che la localizzazione anteroposteriore delle proteine PCP è fondamentale per l’intercalazione cellulare, anche se non escludono ruoli aggiuntivi nelle protrusioni mediolaterali, e la rottura del PCP disturba la polarità e la stabilità delle protrusioni mediolaterali (Wallingford et al., 2000). È significativo che lavori recenti suggeriscano che sia le protrusioni mediolaterali che la contrazione della giunzione agiscono insieme durante l’estensione convergente (Sun et al., 2017; Williams et al., 2014), quindi è chiaro che saranno necessari ulteriori studi.

A nostro avviso, i risultati più importanti qui riguardano gli aspetti temporali della localizzazione della proteina PCP, in quanto gli studi precedenti hanno fornito solo istantanee statiche di quello che è un processo altamente dinamico. I nostri studi time-lapse non solo rivelano che Prickle2 e Vangl2 sono dinamicamente arricchiti in giunzioni che si restringono, ma suggeriscono anche che lo stato di restringimento/ crescita di una giunzione può essere un fattore determinante per l’arricchimento della proteina PCP tanto quanto il suo orientamento lungo gli assi mediolaterale/anteroposteriore. Inoltre, i nostri dati FRAP rivelano che anche la cinetica di rotazione differisce con il comportamento dinamico delle giunzioni, con frazioni stabili più elevate associate a giunzioni che si restringono. Così, il nostro studio rivela una nuova complessità al modello di localizzazione della proteina PCP che probabilmente riflette la natura dinamica delle cellule coinvolte, in quanto si scambiano costantemente i vicini mentre si intercalano.

Infine, i nostri dati forniscono un interessante complemento agli studi precedenti che collegano il turnover alle giunzioni cellulari alla localizzazione della proteina PCP polarizzata planare. A Drosophila, le regioni arricchite della localizzazione della proteina PCP mostrano frazioni stabili più elevate rispetto alle regioni non arricchite, e la perdita della localizzazione asimmetrica della proteina dopo aver interrotto la segnalazione del PCP è accompagnata da una perdita di questo turnover asimmetrico (Strutt et al., 2011). Risultati simili sono stati ottenuti nelle cellule dell’epidermide dello Xenopus e nell’ovidotto murino (Butler e Wallingford, 2015; Chien et al., 2015; Shi et al., 2016). Tuttavia, lo scambio cellula-cellula vicina è minimo in quei contesti, a differenza di CE, dove tali scambi vicini sono costanti. Troviamo quindi interessante che abbiamo osservato una tendenza simile durante l’intercalazione cellulare, dove le regioni arricchite della localizzazione della proteina PCP mostrano anche frazioni più alte e stabili della proteina PCP, anche se queste giunzioni si restringono drasticamente. È interessante notare che, quando abbiamo calcolato la frazione media stabile per le proteine PCP (cioè la media di tutte le giunzioni), questo valore era sostanzialmente inferiore a quello che abbiamo osservato in precedenza con metodi simili nelle cellule multiciliate di Xenopus (Butler e Wallingford, 2015); questa differenza può rappresentare un adattamento alla natura dinamica delle giunzioni coinvolte. Insieme agli studi precedenti, i nostri dati dimostrano che la cinetica di rotazione delle giunzioni planari polarizzate è una caratteristica generale della localizzazione della proteina PCP, che abbraccia un ampio spettro di organismi e tipi di cellule.

L’interazione tra la proteina PCP e la miosina durante l’estensione convergente

Un altro risultato interessante di questo studio è lo stretto rapporto spazio-temporale tra le proteine del PCP e la miosina alle giunzioni di contrazione. È stato dimostrato che le proteine PCP sono necessarie per la fosforilazione della miosina durante l’intercalazione cellulare nello xenopus, nei pulcini e nei topi (Lienkamp et al., 2012; McGreevy et al., 2015; Nishimura et al., 2012; Shindo e Wallingford, 2014; Williams et al., 2014), così come nella coclea dei topi (Lee et al., 2012). Il meccanismo con cui le proteine PCP agiscono sulla miosina rimane poco chiaro, ma delle proteine PCP è il Dvl ad essere più direttamente coinvolto. Il Dvl agisce attraverso la formina Daam1, il PDZ-RhoGEF, e la RhoA per attivare la Rho Kinase (Habas et al., 2001; Nishimura et al., 2012), che a sua volta è essenziale per l’intercalazione cellulare (Marlow et al., 2002; Ybot-Gonzalez et al., 2007). Quindi, la nostra attenzione qui su Prickle e Vangl (resa necessaria dalla complessità della funzione Dvl/Fzd) è un limite, perché i meccanismi con cui Pk2 e Vangl2 impattano l’attivazione della miosina sono sconosciuti.

Poiché il feedback meccanico contribuisce alle oscillazioni di actomiosina alle giunzioni di contrazione durante l’intercalazione cellulare indipendente dal PCP in Drosophila (ad esempio [Fernandez-Gonzalez et al., 2009]), un’ipotesi attraente coinvolge Dvl / RoA-mediata accumulo di miosina su una faccia cellulare con conseguente accumulo di miosina meccanicamente indotta sulla faccia della cellula opposta. In questo caso, Pk2 e Vangl2 funzionano solo per garantire la localizzazione Dvl/Fzd dall’altro lato della giunzione. In alternativa, Pk2 e Vangl2 possono anche interagire direttamente con i macchinari di actomiosina da un meccanismo ancora da descrivere.

Indipendentemente dal meccanismo preciso, è chiaro che è necessario un sistema PCP funzionale per guidare la contrazione della miosina, quindi è interessante che due studi recenti suggeriscono che, al contrario, la miosina è necessaria per la normale localizzazione della proteina PCP. L’interruzione dell’azione della miosina interrompe la localizzazione polarizzata di Vangl2 nella placca neurale di Xenopus e di Pk nella notocorda ascidica (Newman-Smith et al., 2015; Ossipova et al., 2015). Questi dati possono suggerire una relazione ‘reciproca’ tra le proteine PCP e la miosina, un’idea supportata dalle nostre osservazioni di una strettissima correlazione temporale e spaziale tra i livelli di miosina e i livelli di Pk2 alle giunzioni cellula-cellula. Tuttavia, poiché ci sono prove che gli stimoli meccanici possono avere un impatto sulla segnalazione del PCP in Drosophila, Xenopus e nei topi (Aigouy et al., 2010; Bosveld et al., 2012; Chien et al., 2015; Luxenburg et al., 2015), è importante considerare che sia la placca neurale che la notocorda sono impegnate in movimenti cellulari collettivi su larga scala. L’ampia applicazione degli inibitori della miosina perturberebbe chiaramente i modelli globali di movimento cellulare e persino l’orientamento e l’entità della tensione esercitata sulle giunzioni cellula-cellula, per cui l’inibizione della miosina potrebbe disturbare secondariamente la localizzazione della proteina PCP. Per affrontare adeguatamente questo problema saranno necessari futuri esperimenti che utilizzino l’inibizione della miosina acuta, risolta spazialmente, per risolvere questo problema.

Conclusioni

In sintesi, i dati qui riportati forniscono una visione quantitativa e dinamica della localizzazione della proteina PCP in relazione al comportamento subcellulare che guida l’intercalazione cellulare. Questo lavoro fornisce nuove intuizioni sul problema generale di come i sistemi di segnalazione dello sviluppo come l’interfaccia PCP con macchine cellulari fondamentali come l’actomiosina. Infine, poiché i difetti nella segnalazione del PCP sono fortemente legati ai difetti del tubo neurale umano, questo lavoro pone anche le basi per comprendere lo spettro crescente delle mutazioni associate alla malattia umana nei geni del PCP.

Materiali e metodi

Manipolazioni di Xenopus

Le uova erano e sono state fecondate esternamente secondo i protocolli standard (Sive et al., 2000). Il cappotto di gelatina è stato rimosso dagli embrioni allo stadio di due cellule facendo il bagno in una soluzione di cisteina al 2% (pH 7,9). Gli embrioni sono stati poi lavati in 1/3x Ringer modificato di Marc (MMR) e microiniettato in una soluzione di 1/3x MMR con il 2% di Ficoll utilizzando un manipolatore di Oxford. La codifica mRNAs per le fusioni proteiche fluorescenti sono stati sintetizzati utilizzando mMessage mMachine kit (Ambion) e iniettato in uno degli otto blastomeri dorsali per l’etichettatura anche della piastra neurale alle seguenti concentrazioni: 50 pg membraneGFP, 60 pg di membraneRFP, 80 pg di membraneBFP, 200 pg per GFP- o RFP-Pk2, 60 pg per GFP-Vangl2, 50 pg per H2B-RFP, e 30 pg per Myl9-GFP. Per i tessuti etichettati a mosaico, gli mRNA sono stati iniettati nelle fasi a 16 o 32 cellule con circa il 70% degli importi totali sopra elencati. Dominante-negativo Pk2 (Pk2-ΔPETΔLIM) è stato iniettato a 700-800 pg per la sovraespressione, allo stadio a otto cellule, come è stato il dominante-negativo Dvl (Xdd1), ed entrambi sono stati analogamente ridotti del 70% per le iniezioni in fase successiva. Per i trattamenti con morfolino Pk2, 20-25 ng sono stati iniettati in una cella allo stadio a otto celle, e 400 pg di GFP-Pk2 sono stati utilizzati per salvare i fenotipi di morfolino. Fasi di sviluppo sono stati determinati secondo (Nieuwkoop e Faber, 1994).

Immagine dal vivo e quantificazione dell’immagine

L’imaging confocale è stato fatto utilizzando embrioni vivi immersi in 1/3x MMR in camere cellulari AttoFluor Cell Chambers (Life Technologies A7816) e tra i vetri di copertura, utilizzando grasso siliconico come distanziatore adesivo, e realizzato con un microscopio confocale Zeiss LSM700. Le immagini sono state elaborate con la distribuzione alle Fiji delle suite di software ImageJ, Imaris (Bitplane) e Photoshop (Adobe) e le figure sono state assemblate in Illustrator (Adobe). Per le misure di lunghezza della giunzione e di arricchimento delle proteine, sono state tracciate delle linee (3-6 pixel di larghezza, a seconda della scala dell’immagine / zoom) sulle regioni giunzionali delle cellule (esclusi i vertici giunzionali tricellulari), mentre le misure citoplasmatiche sono state prese utilizzando gli strumenti di forma a mano libera all’interno delle regioni corticali apicolaterali. Intensità medie di fluorescenza PCP e Myl9 lungo una giunzione cellula-cellula sono stati normalizzati a contro l’etichetta della membrana in analisi dei cambiamenti di PCP vs. durante i cambiamenti di lunghezza della giunzione (Supp. Figura 6) e contro la media delle intensità citoplasmatiche delle due cellule che condividono una giunzione nelle analisi quando le cellule sono etichettati. (Figure 1B e 8C). Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software Prism (Graphpad) con i test di Mann Whitney per le correlazioni non parametriche di significato e Spearman. Sono stati eliminati dall’analisi gli outlier estremi con intensità di fluorescenza più di tre deviazioni standard dalla media; in tutti i dataset tali outlier erano molto rari (<6). Questi valori anomali rappresentano probabilmente onde di contrazione non specifiche, talvolta osservate nella placca neurale di Xenopus. Per l’analisi FRAP, i filmati time-lapse sono stati acquisiti dopo la localizzazione di fusioni PCP GFP del core PCP a domini discreti di photobleaching. Le misurazioni dell’intensità sono state effettuate alle Fiji, con registrazioni per ogni punto temporale prese singolarmente da ogni fotogramma catturate in regioni sbiancate e normalizzate come descritto in Goldman e Spector (2005). L’analisi statistica è stata eseguita nel software Prism (Graphpad) con funzioni di decadimento esponenziale. Gli angoli delle giunzioni che si restringono a formare ed emergono dalle rosette sono stati misurati manualmente nelle Fiji, e i diagrammi a rose sono stati tracciati con il software Oriana (Kovach Computing Services). L’analisi della correlazione incrociata è stata eseguita utilizzando un calcolatore statistico gratuito basato sul web all’indirizzo www.wessa.net. L’imaging stereo time-lapse è stato eseguito utilizzando uno stereomicroscopio Zeiss AXIO Zoom.V16 e il software Zen associato. I filmati sono stati esportati dalle Fiji ed elaborati in Adobe Photoshop, e il tracking delle cellule è stato eseguito con il plug-in di tracking manuale delle Fiji.

References

Aigouy B, Farhadifar R, Staple DB, Sagner A, Röper JC, Jülicher F, Eaton S. Cell flow reorients the axis of planar polarity in the wing epithelium of Drosophila. Cell. 2010; 142:773-786. DOI | PubMed
Antic D, Stubbs JL, Suyama K, Kintner C, Scott MP, Axelrod JD. Planar cell polarity enables posterior localization of nodal cilia and left-right axis determination during mouse and Xenopus embryogenesis. PLoS One. 2010; 5DOI | PubMed
Axelrod JD. Unipolar membrane association of dishevelled mediates frizzled planar cell polarity signaling. Genes & Development. 2001; 15:1182-1187. DOI | PubMed
Bastock R, Strutt H, Strutt D. Strabismus is asymmetrically localised and binds to Prickle and Dishevelled during Drosophila planar polarity patterning. Development. 2003; 130:3007-3014. DOI | PubMed
Bertet C, Sulak L, Lecuit T. Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation. Nature. 2004; 429:667-671. DOI | PubMed
Blankenship JT, Backovic ST, Sanny JS, Weitz O, Zallen JA. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 2006; 11:459-470. DOI | PubMed
Borovina A, Superina S, Voskas D, Ciruna B. Vangl2 directs the posterior tilting and asymmetric localization of motile primary cilia. Nature Cell Biology. 2010; 12:407-412. DOI | PubMed
Bosveld F, Bonnet I, Guirao B, Tlili S, Wang Z, Petitalot A, Marchand R, Bardet PL, Marcq P, Graner F, Bellaïche Y. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 2012; 336:724-727. DOI | PubMed
Burkel BM, von Dassow G, Bement WM. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 2007; 64:822-832. DOI | PubMed
Butler MT, Wallingford JB. Control of vertebrate core planar cell polarity protein localization and dynamics by Prickle 2. Development. 2015; 142:3429-3439. DOI | PubMed
Butler MT, Wallingford JB. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2017; 18:375-388. DOI | PubMed
Chien YH, Keller R, Kintner C, Shook DR. Mechanical strain determines the axis of planar polarity in ciliated epithelia. Current Biology. 2015; 25:2774-2784. DOI | PubMed
Ciruna B, Jenny A, Lee D, Mlodzik M, Schier AF. Planar cell polarity signalling couples cell division and morphogenesis during neurulation. Nature. 2006; 439:220-224. DOI | PubMed
Darken RS, Scola AM, Rakeman AS, Das G, Mlodzik M, Wilson PA. The planar polarity gene strabismus regulates convergent extension movements in Xenopus. The EMBO Journal. 2002; 21:976-985. DOI | PubMed
De Marco P, Merello E, Piatelli G, Cama A, Kibar Z, Capra V. Planar cell polarity gene mutations contribute to the etiology of human neural tube defects in our population. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 2014; 100:633-641. DOI | PubMed
Elul T, Koehl MA, Keller R. Cellular mechanism underlying neural convergent extension in Xenopus laevis embryos. Developmental Biology. 1997; 191:243-258. DOI | PubMed
Fernandez-Gonzalez R, Simoes SM, Röper JC, Eaton S, Zallen JA. Myosin II dynamics are regulated by tension in intercalating cells. Developmental Cell. 2009; 17:736-743. DOI | PubMed
Goldman RD, Spector DL. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. CSHL Press: Cold Spring Harbor, NY; 2005.
Goto T, Davidson L, Asashima M, Keller R. Planar cell polarity genes regulate polarized extracellular matrix deposition during frog gastrulation. Current Biology. 2005; 15:787-793. DOI | PubMed
Goto T, Keller R. The planar cell polarity gene strabismus regulates convergence and extension and neural fold closure in Xenopus. Developmental Biology. 2002; 247:165-181. DOI | PubMed
Habas R, Kato Y, He X. Wnt/Frizzled activation of Rho regulates vertebrate gastrulation and requires a novel Formin homology protein Daam1. Cell. 2001; 107:843-854. DOI | PubMed
Hashimoto M, Shinohara K, Wang J, Ikeuchi S, Yoshiba S, Meno C, Nonaka S, Takada S, Hatta K, Wynshaw-Boris A, Hamada H. Planar polarization of node cells determines the rotational axis of node cilia. Nature Cell Biology. 2010; 12:170-176. DOI | PubMed
Jiang D, Munro EM, Smith WC. Ascidian prickle regulates both mediolateral and anterior-posterior cell polarity of notochord cells. Current Biology. 2005; 15:79-85. DOI | PubMed
Juriloff DM, Harris MJ. A consideration of the evidence that genetic defects in planar cell polarity contribute to the etiology of human neural tube defects. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 2012; 94:824-840. DOI | PubMed
Keller R, Hardin J. Cell behaviour during active cell rearrangement: evidence and speculations. Journal of Cell Science. 1987; 8:369-393. DOI | PubMed
Keller R, Shih J, Sater A. The cellular basis of the convergence and extension of the Xenopus neural plate. Developmental Dynamics. 1992; 193:199-217. DOI | PubMed
Kibar Z, Vogan KJ, Groulx N, Justice MJ, Underhill DA, Gros P. Ltap, a mammalian homolog of Drosophila Strabismus/Van Gogh, is altered in the mouse neural tube mutant Loop-tail. Nature Genetics. 2001; 28:251-255. DOI | PubMed
Kieserman EK, Lee C, Gray RS, Park TJ, Wallingford JB. High-magnification in vivo imaging of Xenopus embryos for cell and developmental biology. Cold Spring Harbor Protocols. 2010; 2010DOI | PubMed
Kinoshita N, Iioka H, Miyakoshi A, Ueno N. PKC delta is essential for Dishevelled function in a noncanonical Wnt pathway that regulates Xenopus convergent extension movements. Genes & Development. 2003; 17:1663-1676. DOI | PubMed
Lee J, Andreeva A, Sipe CW, Liu L, Cheng A, Lu X. PTK7 regulates myosin II activity to orient planar polarity in the mammalian auditory epithelium. Current Biology. 2012; 22:956-966. DOI | PubMed
Lienkamp SS, Liu K, Karner CM, Carroll TJ, Ronneberger O, Wallingford JB, Walz G. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent, rosette-based mechanism of convergent extension. Nature Genetics. 2012; 44:1382-1387. DOI | PubMed
Luxenburg C, Heller E, Pasolli HA, Chai S, Nikolova M, Stokes N, Fuchs E. Wdr1-mediated cell shape dynamics and cortical tension are essential for epidermal planar cell polarity. Nature Cell Biology. 2015; 17:592-604. DOI | PubMed
Marlow F, Topczewski J, Sepich D, Solnica-Krezel L. Zebrafish Rho kinase 2 acts downstream of Wnt11 to mediate cell polarity and effective convergence and extension movements. Current Biology. 2002; 12:876-884. DOI | PubMed
McGreevy EM, Vijayraghavan D, Davidson LA, Hildebrand JD. Shroom3 functions downstream of planar cell polarity to regulate myosin II distribution and cellular organization during neural tube closure. Biology Open. 2015; 4:186-196. DOI | PubMed
Newman-Smith E, Kourakis MJ, Reeves W, Veeman M, Smith WC. Reciprocal and dynamic polarization of planar cell polarity core components and myosin. eLife. 2015; 4DOI | PubMed
Nieuwkoop PD, Faber J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). 1994.
Ninomiya H, Elinson RP, Winklbauer R. Antero-posterior tissue polarity links mesoderm convergent extension to axial patterning. Nature. 2004; 430:364-367. DOI | PubMed
Nishimura T, Honda H, Takeichi M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 2012; 149:1084-1097. DOI | PubMed
Ossipova O, Kim K, Sokol SY. Planar polarization of Vangl2 in the vertebrate neural plate is controlled by Wnt and Myosin II signaling. Biology Open. 2015; 4:722-730. DOI | PubMed
Panousopoulou E, Tyson RA, Bretschneider T, Green JB. The distribution of Dishevelled in convergently extending mesoderm. Developmental Biology. 2013; 382:496-503. DOI | PubMed
Paré AC, Vichas A, Fincher CT, Mirman Z, Farrell DL, Mainieri A, Zallen JA. A positional Toll receptor code directs convergent extension in Drosophila. Nature. 2014; 515:523-527. DOI | PubMed
Rauzi M, Verant P, Lecuit T, Lenne PF. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 2008; 10:1401-1410. DOI | PubMed
Rida PC, Chen P. Line up and listen: Planar cell polarity regulation in the mammalian inner ear. Seminars in Cell & Developmental Biology. 2009; 20:978-985. DOI | PubMed
Roszko I, S Sepich D, Jessen JR, Chandrasekhar A, Solnica-Krezel L. A dynamic intracellular distribution of Vangl2 accompanies cell polarization during zebrafish gastrulation. Development. 2015; 142:2508-2520. DOI | PubMed
Schroeder TE. Neurulation in Xenopus Laevis. an analysis and model based upon light and electron microscopy. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 1970; 23:427-462. PubMed
Shi D, Usami F, Komatsu K, Oka S, Abe T, Uemura T, Fujimori T. Dynamics of planar cell polarity protein Vangl2 in the mouse oviduct epithelium. Mechanisms of Development. 2016; 141:78-89. DOI | PubMed
Shih J, Keller R. Cell motility driving mediolateral intercalation in explants of xenopus laevis. Development. 1992; 116:901-914. PubMed
Shindo A, Wallingford JB. PCP and septins compartmentalize cortical actomyosin to direct collective cell movement. Science. 2014; 343:649-652. DOI | PubMed
Sive HL, Grainger RM, Harland RM. Early Development of Xenopus Laevis: A Laboratory Manual. 2000.
Sokol SY. Analysis of Dishevelled signalling pathways during Xenopus development. Current Biology. 1996; 6:1456-1467. DOI | PubMed
Strutt DI. Asymmetric localization of frizzled and the establishment of cell polarity in the Drosophila wing. Molecular Cell. 2001; 7:367-375. DOI | PubMed
Strutt H, Strutt D. Asymmetric localisation of planar polarity proteins: Mechanisms and consequences. Seminars in Cell & Developmental Biology. 2009; 20:957-963. DOI | PubMed
Strutt H, Warrington SJ, Strutt D. Dynamics of core planar polarity protein turnover and stable assembly into discrete membrane subdomains. Developmental Cell. 2011; 20:511-525. DOI | PubMed
Sun Z, Amourda C, Shagirov M, Hara Y, Saunders TE, Toyama Y. Basolateral protrusion and apical contraction cooperatively drive Drosophila germ-band extension. Nature Cell Biology. 2017; 19:375-383. DOI | PubMed
Tada M, Heisenberg CP. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Development. 2012; 139:3897-3904. DOI | PubMed
Takeuchi M, Nakabayashi J, Sakaguchi T, Yamamoto TS, Takahashi H, Takeda H, Ueno N. The prickle-related gene in vertebrates is essential for gastrulation cell movements. Current Biology. 2003; 13:674-679. DOI | PubMed
Tree DR, Shulman JM, Rousset R, Scott MP, Gubb D, Axelrod JD. Prickle mediates feedback amplification to generate asymmetric planar cell polarity signaling. Cell. 2002; 109:371-381. DOI | PubMed
Trichas G, Smith AM, White N, Wilkins V, Watanabe T, Moore A, Joyce B, Sugnaseelan J, Rodriguez TA, Kay D, Baker RE, Maini PK, Srinivas S. Multi-cellular rosettes in the mouse visceral endoderm facilitate the ordered migration of anterior visceral endoderm cells. PLoS Biology. 2012; 10DOI | PubMed
Walck-Shannon E, Hardin J. Cell intercalation from top to bottom. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2014; 15:34-48. DOI | PubMed
Wallingford JB, Harland RM. Xenopus dishevelled signaling regulates both neural and mesodermal convergent extension: parallel forces elongating the body Axis. Development. 2001; 128:2581-2592. PubMed
Wallingford JB, Harland RM. Neural tube closure requires Dishevelled-dependent convergent extension of the midline. Development. 2002; 129:5815-5825. DOI | PubMed
Wallingford JB, Niswander LA, Shaw GM, Finnell RH. The continuing challenge of understanding, preventing, and treating neural tube defects. Science. 2013; 339DOI | PubMed
Wallingford JB, Rowning BA, Vogeli KM, Rothbächer U, Fraser SE, Harland RM. Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation. Nature. 2000; 405:81-85. DOI | PubMed
Wallingford JB. Planar cell polarity signaling, cilia and polarized ciliary beating. Current Opinion in Cell Biology. 2010; 22:597-604. DOI | PubMed
Williams M, Yen W, Lu X, Sutherland A. Distinct apical and basolateral mechanisms drive planar cell polarity-dependent convergent extension of the mouse neural plate. Developmental Cell. 2014; 29:34-46. DOI | PubMed
Ybot-Gonzalez P, Savery D, Gerrelli D, Signore M, Mitchell CE, Faux CH, Greene ND, Copp AJ. Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 2007; 134:789-799. DOI | PubMed
Yin C, Kiskowski M, Pouille PA, Farge E, Solnica-Krezel L. Cooperation of polarized cell intercalations drives convergence and extension of presomitic mesoderm during zebrafish gastrulation. The Journal of Cell Biology. 2008; 180:221-232. DOI | PubMed
Zallen JA, Wieschaus E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 2004; 6:343-355. DOI | PubMed

Fonte

Butler MT, Wallingford JB, Solnica-Krezel L, Stainier DY () Spatial and temporal analysis of PCP protein dynamics during neural tube closure. eLife 7e36456. https://doi.org/10.7554/eLife.36456