La colonizzazione batterica stimola una risposta fisiologica complessa nell’epitelio intestinale umano immaturo

Abstract

Il tratto gastrointestinale umano è immaturo alla nascita, ma deve adattarsi a cambiamenti drammatici come la nutrizione orale e la colonizzazione microbica. La confluenza di questi fattori può portare a gravi malattie infiammatorie nei neonati prematuri; tuttavia, indagare le complesse interazioni ambiente-ospite è difficile a causa di un accesso limitato al tessuto umano immaturo. Qui, dimostriamo che l'epitelio di cellule staminali umane pluripotenti derivate da cellule staminali umane è globalmente simile all'epitelio umano immaturo e utilizziamo HIO per indagare complesse interazioni ambiente-host-microbo in questo epitelio ingenuo. I nostri risultati dimostrano che l'epitelio immaturo è intrinsecamente in grado di stabilire una stabile simbiosi ospite-microbo. La colonizzazione microbica porta a complesse risposte di contatto e ipossia con conseguente aumento della produzione di peptidi antimicrobici, maturazione dello strato di muco e miglioramento della funzione di barriera. Questi studi gettano le basi per una migliore comprensione meccanicistica di come la colonizzazione influenza lo sviluppo dell'intestino umano immaturo.

Introduzione

L’epitelio del tratto gastrointestinale (IG) rappresenta un’ampia superficie per l’interazione ospite-microbo e media l’equilibrio tra la tolleranza degli organismi mutualistici e l’esclusione di potenziali agenti patogeni(Peterson e Artis, 2014). Ciò avviene, in parte, attraverso la formazione di una stretta barriera fisica epiteliale, oltre alla secrezione epiteliale di peptidi antimicrobici e muco(Veereman-Wauters, 1996; Renz et al., 2011). Lo sviluppo e la maturazione della barriera epiteliale coincide con la prima esposizione del tratto gastrointestinale ai microrganismi e la creazione di una comunità microbica all’interno dell’intestino(Palmer et al., 2007; Koenig et al., 2011). Sebbene i microrganismi siano stati a lungo apprezzati come i principali motori dell’espansione postnatale dell’immunità adattativa(Renz et al., 2011; Shaw et al., 2010; Hviid et al., 2011; Abrahamsson et al., 2014; Arrieta et al., 2015), e più recentemente come stimoli chiave nello sviluppo della digestione(Erkosar et al.,2015), del metabolismo(Cho et al., 2012) e della funzione neurocognitiva(Diaz Heijtz et al., 2011; Clarke et al., 2014; Borre et al., 2014; Desbonnet et al., 2014), non è ancora chiaro come la superficie epiteliale umana si adatti alla colonizzazione e all’espansione dei microrganismi all’interno del tratto GI immaturo.

Gli studi sui topi gnotobiotici hanno migliorato la nostra comprensione dell’importanza dei microbi nella normale funzione intestinale, poiché questi topi mostrano profondi difetti di sviluppo nell’intestino(Round and Mazmanian, 2009; Gensollen et al., 2016; Bry et al, 1996; Hooper et al., 1999), tra cui la diminuzione del turnover epiteliale, la ridotta formazione di microvilli(Abrams et al., 1963) e l’alterazione della glicosilazione del muco sulla superficie epiteliale(Bry et al., 1996; Goto et al., 2014; Cash et al., 2006). Tuttavia, l’evidenza suggerisce anche che l’intestino umano immaturo può differire significativamente dall’intestino murino, specialmente nel contesto della malattia(Nguyen et al., 2015). Ad esempio, i neonati prematuri possono sviluppare un’enterocolite necrotizzante (NEC), una malattia infiammatoria di cause sconosciute. Recenti rapporti suggeriscono un’eziologia multifattoriale secondo la quale la funzione di barriera intestinale immaturo predispone il neonato pretermine a lesioni intestinali e infiammazioni in seguito a colonizzazione microbica post-partum(Neu and Walker, 2011; Morrow et al., 2013; Greenwood et al., 2014; Hackam et al., 2013; Afrazi et al., 2014; Fusunyan et al., 2001; Nanthakumar et al., 2011). I modelli di roditori di NEC si sono rivelati dei surrogati inadeguati per lo studio delle malattie umane(Tanner et al., 2015). Pertanto, gli studi diretti delle interazioni medico-microbiche nell’intestino umano immaturo saranno importanti per comprendere le complesse interazioni durante la colonizzazione batterica che portano ad un normale sviluppo intestinale o ad una malattia.

Importanti considerazioni etiche e pratiche hanno limitato la ricerca sull’intestino umano immaturo. Ad esempio, i campioni chirurgici neonatali sono spesso gravemente danneggiati dalla malattia e non sono adatti per gli studi ex vivo. Noi e altri abbiamo già dimostrato in precedenza che gli organi intestinali umani pluripotenti derivati da cellule staminali umane (HIO) assomigliano strettamente al tessuto intestinale immaturo(Spence et al., 2011; Finkbeiner et al., 2015; Watson et al., 2014; Forster et al., 2014; Dedhia et al., 2016; Aurora e Spence, 2016; Chin et al., 2017) e lavori recenti hanno stabilito che gli organoidi gastrointestinali sono un potente modello di patogenesi microbica all’interfaccia mucosa(Leslie et al., 2015; McCracken et al., 2014; Forbester et al., 2015; Hill e Spence, 2017).

Nel lavoro attuale, abbiamo usato gli HIO come epitelio intestinale immaturo modello e un ceppo umano non patogeno di E. coli come colonizzatore intestinale modello per esaminare come le interazioni ospite-microbico influiscono sulla maturazione e la funzione intestinale. Sebbene la composizione del microbioma intestinale neonatale varia da individuo a individuo, gli organismi dei generi Escherichia sono colonizzatori precoci dominanti(Gosalbes et al., 2013; Bäckhed et al., 2015) e l’E. coli non patogeno sono componenti ampiamente prevalenti e molto abbondanti del microbioma delle feci neonatali (Palmer et al.,2007; Koenig et al., 2011; Bäckhed et al., 2015; Morrow et al., 2013). La microiniezione di E. coli nel lume di HIO tridimensionale ha portato alla colonizzazione batterica stabile in vitro e, utilizzando il sequenziamento dell’RNA, abbiamo monitorato i cambiamenti trascrizionali globali in risposta alla colonizzazione. Abbiamo osservato risposte trascrizionali diffuse, dipendenti dal tempo, che sono il risultato sia del contatto batterico che dell’ipossia luminale risultante dalla colonizzazione batterica nell’HIO. L’associazione batterica con l’epitelio immaturo ha aumentato le difese antimicrobiche e ha portato ad un miglioramento della funzione di barriera epiteliale e dell’integrità. Abbiamo osservato che NF-κB è un mediatore centrale a valle dei cambiamenti trascrizionali indotti sia dal contatto batterico che dall’ipossia. Abbiamo ulteriormente sondato il contatto batterico e le risposte epiteliali ipossia-dipendenti utilizzando l’ipossia sperimentale e l’inibizione farmacologica NF-κB, che ci ha permesso di delineare quali delle risposte trascrizionali e funzionali dell’epitelio immaturo erano dipendenti dall’ossigeno e/o NF-κB. Abbiamo scoperto che le interazioni microbico-epiteliali NF-κB-dipendenti sono state benefiche per il miglioramento della funzione di barriera e per la protezione dell’epitelio da danni causati da citochine infiammatorie. Collettivamente, questi studi fanno luce su come il contatto microbico con l’epitelio intestinale umano immaturo può portare ad una funzione modificata.

Risultati

L’epitelio intestinale derivato da cellule staminali pluripotenti trascrizionalmente assomiglia all’epitelio intestinale umano immaturo

Precedenti lavori hanno dimostrato che gli organi intestinali umani derivati da cellule staminali assomigliano a duodeno umano immaturo(Watson et al., 2014; Finkbeiner et al., 2015; Tsai et al., 2017). Inoltre, il trapianto in topi immunocompromessi porta alla maturazione dell’HIO in uno stato simile a quello degli adulti(Watson et al., 2014; Finkbeiner et al., 2015). Queste analisi hanno confrontato gli IO costituiti da epitelio e mesenchima con il tessuto intestinale umano a tutto spessore, che possedeva anche costituenti cellulari privi di IO come neuroni, vasi sanguigni e cellule immunitarie(Finkbeiner et al., 2015). Pertanto, la misura in cui l’epitelio HIO assomiglia all’epitelio intestinale immaturo/fetale è rimasta poco chiara. Per affrontare questa lacuna e caratterizzare ulteriormente l’epitelio HIO rispetto all’epitelio duodenale fetale e adulto, abbiamo isolato e coltivato epitelio da HIO cresciuto interamente in vitro, da duodeno fetale, duodeno adulto, o HIO che era stato trapiantato nella capsula renale di topi immunodeficienti NSG e maturato per 10 settimane. Questi organoidi derivati solo dall’epitelio sono stati espansi in vitro in condizioni di coltura tissutale uniforme per 4-5 passaggi e trattati per il sequenziamento dell’RNA (RNA-seq) (Figura 1-figure supplement 1). Confronto dei trascrittomi globali tra tutti i campioni oltre alle cellule staminali embrionali umane (hESC) utilizzate per generare HIO(Finkbeiner et al., 2015; E-MTAB-3158) ha rivelato una chiara gerarchia in cui sia in vitro cresciuto epitelio HIO cresciuto (p = 5,06 × 10-9)^e l’epitelio trapiantato (p = 7,79 × 10-14) condivide un grado sostanzialmente maggiore di somiglianza con l’epitelio del piccolo intestino fetale (Figura 1-figuresupplement 1A).

Mentre il clustering imparziale ha dimostrato che l’epitelio trapiantato assomiglia molto a epitelio fetale, abbiamo notato uno spostamento verso il trascrittoma adulto che ha portato ad un aumento relativo della correlazione tra epitelio HIO trapiantato e l’epitelio adulto derivato dal duodeno cresciuto in vitro(Figura 1-figure supplement 1B, p = 1,17 × 10-4). Analisi dei componenti principali (PCA) di questo multi-dimensionale set di dati di espressione genica(Figura 1-figure supplement 1C) ha corroborato l’analisi di correlazione, e ha indicato che PC1 è stato correlato con lo stadio di sviluppo (PC1, 27,75% varianza cumulativa) e PC2 è stato correlato con lo stato di maturazione dei tessuti (PC2, 21.49% di varianza cumulativa); cumulativamente, PC1 e PC2 rappresentavano il 49,24% della varianza cumulativa tra i campioni, suggerendo che lo stadio di sviluppo e lo stato di maturazione dei tessuti sono le fonti principali della variazione trascrizionale tra i campioni. Epitelio HIO agglomerato con epitelio fetale lungo PC2, mentre l’epitelio HIO trapiantato agglomerato con epitelio adulto.

Abbiamo inoltre utilizzato l’analisi dell’espressione differenziale per dimostrare che l’epitelio HIO cresciuto in vitro è simile all’intestino umano immaturo, mentre l’epitelio HIO trapiantato in vivo è simile all’epitelio adulto. Per fare questo, abbiamo identificato i geni espressi in modo differenziato attraverso due confronti indipendenti: (1) epitelio fetale umano vs. epitelio adulto; (2) epitelio HIO vs. epitelio HIO trapiantato. I geni arricchiti in epitelio HIO trapiantato rispetto all’epitelio HIO sono stati confrontati con i geni arricchiti nel duodeno adulto rispetto al duodeno fetale(Figura 1-figure supplement 1D). C’era una correlazione altamente significativa tra i rapporti di espressione log2-trasformati in cui gli IO trapiantati e l’epitelio adulto condividevano geni arricchiti mentre l’IO e l’epitelio fetale condividevano geni arricchiti (p=2,6 × 10-28). Questa analisi supporta i dati pubblicati in precedenza che indicano che l’epitelio di IO cresciuto in vitro ricapitola la firma di espressione genica del duodeno immaturo e dimostra che l’epitelio IO è in grado di adottare una firma trascrizionale che assomiglia maggiormente al duodeno adulto dopo il trapianto nei topi.

Gli HIO possono essere associati in modo stabile con l’E. coli non patogeno

Dato che l’epitelio HIO ricapitola molte delle caratteristiche dell’epitelio intestinale immaturo, ci siamo proposti di valutare l’effetto della colonizzazione batterica sull’epitelio HIO ingenuo. Studi precedenti hanno stabilito che gli organi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti possono essere iniettati con virus vivi(Finkbeiner et al., 2012) o con agenti patogeni batterici(Leslie et al., 2015; Engevik et al., 2015; Forbester et al. , 2015); tuttavia, non si sapeva se gli HIO potessero essere co-colturati in modo stabile con microrganismi non patogeni. Abbiamo co-coltivato gli IO con il ceppo non mobile di Esherichia coli di derivazione umana ECOR2(Ochman e Selander, 1984). L’intero sequenziamento del genoma e l’analisi filogenetica hanno dimostrato che l ‘E. col i str. ECOR2 è strettamente correlato ad altri E. coli umani non patogeni e solo lontanamente correlati con E. col i patogeni e isolati di Shigella(Figura 1-figure supplement 3). Abbiamo sviluppato una tecnica di microiniezione per introdurre E. col i vivo nel lume HIO in modo da evitare la contaminazione dei mezzi circostanti(Figura 1-figure supplement 2). Gli HIO microiniettati con¹⁰⁵ E. col i vivi che esprimono in modo costitutivo le GFP mostrano una robusta fluorescenza verde entro 3 ore dalla microiniezione(Figura 1A e Video 1). Numerosi E. col i localizzati nello spazio luminale a 48 ore dopo la microiniezione e sono presenti adiacenti all’epitelio HIO, con alcuni apparentemente residenti in stretta opposizione alla superficie epiteliale apicale(Figura 1B).

Al fine di determinare il numero minimo di unità di formazione della colonia (CFU) di E. col i necessari per stabilire la colonizzazione a breve termine (24 ore), abbiamo microiniettato un numero crescente di E. coli vivo sospeso in PBS in HIOs singolo e raccolto e determinato il numero di batteri nel contenuto luminale a 24 ore post-microiniezione(Figura 1C). I singoli HIO possono essere colonizzati in modo stabile da un minimo di 5 CFU E. coli per HIO con il 77,8% di successo (cultura luminale positiva e media culture esterne negative a 24 ore dopo l’iniezione) e il 100% di successo a ≥100 CFU per HIO (Figura 1C). L’aumento del numero di CFU E. coli microiniettato in ogni HIO a t= 0 ha portato ad un significativo aumento del CFU luminale medio per HIO a 24 ore dopo la microiniezione a qualsiasi dose (ANOVA p=0,37; Figura 1C) . Così, il tasso di crescita di 24 ore di E. coli all’interno del lume HIO (CFU×HIOt = 24-1CFU×HIOt = 0-1) è stato correlato negativamente con il CFU iniettato (r2 = 0,625, p = 3,1 × 10-12; Figura 1C).

Successivamente, abbiamo esaminato la stabilità delle co-colture di HIO e di E. coli nel tempo in vitro. Gli HIO sono stati microiniettati con 10 CFU E. col i e mantenuti per 24-72 ore (Figura 1D). Rapida espansione di E. coli densità all’interno del lume HIO è stata osservata nelle prime 24 ore, con densità batterica relativamente stabile a 48-72 ore. Un aumento di 6,25 volte la densità batterica è stato osservato tra 24 e 72 ore dopo la microiniezione (p = 0,036). È importante notare che i campioni prelevati dai terreni di coltura HIO esterni erano negativi per la crescita dell’E. coli.

Infine, abbiamo esaminato la stabilità delle colture HIO dopo la microiniezione di E. col i(Figura 1E). Un totale di 48 singoli HIO sono stati sottoposti a microiniezione con 104 CFU E. col i ciascuno. I controlli sono stati microiniettati con il solo PBS sterile. Abbiamo scoperto che i mezzi di coltura esterni erano sterili nel 100% degli HIO di controllo durante l’intero esperimento, e nel 100% degli HIO iniettati con E . col i nei giorni 0-2 post-microiniezione. Nei giorni 3-9 post-microiniezione alcuni terreni di coltura erano positivi per la crescita dell’E. coli; tuttavia, il 77,08% degli IIO iniettati con E. coli erano negativi per l’E. coli nei terreni di coltura esterni durante tutto l’arco di tempo. Sono stati condotti ulteriori esperimenti di controllo per determinare se i mezzi di coltura HIO hanno avuto un effetto sulla crescita dell’E. coli. I terreni di coltura HIO inoculati con E. coli hanno dimostrato che i terreni stessi hanno permesso una robusta crescita batterica e quindi l’assenza di crescita di E. coli in terreni esterni provenienti da colture HIO non poteva essere attribuita alla sola composizione dei terreni(Figura 1-figure supplement 3). Pertanto, la grande maggioranza degli HIO colonizzati da E. col i rimane stabile per un periodo prolungato quando viene coltivata in vitro e senza antibiotici.

La colonizzazione batterica provoca una risposta trascrizionale su larga scala, dipendente dal tempo

La colonizzazione dell’intestino immaturo da parte dei microbi è associata alla maturazione funzionale in entrambi i sistemi modello (Kremeret al., 2013; Sommer et al., 2015; Broderick et al., 2014; Erkosar et al., 2015) e nei neonati umani (Renz et al.,2011). Per valutare se l’esposizione degli HIO all’E. coli ha portato alla maturazione dell’interfaccia epiteliale, abbiamo valutato gli eventi trascrizionali che seguono la microiniezione di E. coli vivo nel lume dell’HIO. HIO iniettati con PBS (controlli) e HIO co-colturati con E. coli sono stati raccolti per l’analisi trascrizionale dopo 24, 48 e 96 ore(Figura 2). A 24 ore dopo la microiniezione, un totale di 2018 geni sono stati espressi in modo differenziato (regolato-FDR < 0,05), e il numero totale di geni espressi in modo differenziato è stato ulteriormente aumentato a 48 e 96 ore dopo la microiniezione rispetto ai controlli PBS-iniezione (Figura 2A). L’analisi dei componenti di principio ha dimostrato che l’attività trascrizionale globale negli IO è significativamente alterata dall’esposizione all’E. coli, con il grado di cambiamento trascrizionale rispetto agli IO di controllo che aumenta nel tempo(Figura 2B).

Gene set enrichment analysis (GSEA)(Subramanian et al., 2005) utilizzando i database GO(Ashburner et al., 2000; Gene Ontology Consortium, 2015) e REACTOME(Croft et al., 2014; Fabregat et al., 2016) per valutare i dati di espressione dell’RNA-seq hanno rivelato cambiamenti coordinati nell’espressione genica relativi alla difesa antimicrobica innata, alla produzione di barriere epiteliali, all’adattamento a basso ossigeno e alla maturazione dei tessuti(Figura 2C). Percorsi di difesa antimicrobica innata, compresi i geni correlati alla segnalazione NF-κB, la produzione di citochine, e la segnalazione del recettore Toll-like receptor (TLR) sono stati fortemente up-regolati a 24 ore dopo la microiniezione e in generale hanno mostrato una diminuzione dell’attivazione in punti successivi. GSEA ha anche rivelato cambiamenti nell’espressione genica coerente con i livelli di ossigeno ridotti o ipossia, compresa l’induzione di segnali pro-angiogenesi. Un certo numero di percorsi relativi alla sintesi e modificazione delle glicoproteine, tra cui mucine O-linked, glicosaminoglicani e proteoglicani, sono stati up-regolati nelle fasi iniziali della risposta trascrizionale (Syndecans, integrine), ha mostrato un inizio un po ‘ritardato (O-linked mucine), o ha mostrato l’attivazione coerente in tutti i punti di tempo post-microiniezione (cheratano solfato e glicosaminoglicano biosintesi). Infine, gli insiemi di geni associati a una serie di processi coinvolti nella maturazione e nello sviluppo dei tessuti hanno seguito un distinto modello di espressione tardivo. Questo includeva termini di ontologia genica ampia per la morfogenesi d’organo, maturazione dello sviluppo, e la regionalizzazione, nonché processi più specifici come la differenziazione delle cellule mesenchimali e muscolari, e processi associati con il sistema nervoso(Figura 2C).

Abbiamo anche fatto correlazioni tra i geni upregulated nei dati RNA-seq(Figura 2D) e fattori proteici presenti nei mezzi di coltura organica a seguito di microiniezione di E. coli(Figura 2E). β-defensina 1 (DEFB1( gene); BD-1 (proteina)) e β-defensina 2 (DEFB4A(gene); BD-2 (proteina)) hanno mostrato modelli distinti di espressione, con sia DEFB1 e il suo prodotto proteico BD-1 stabile a 24 ore dopo la microiniezione di E. coli, ma relativamente soppressa in punti di tempo successivi, e DEFB4A e BD-2 fortemente indotta in punti di tempo precoce e cedendo nel tempo rispetto ai controlli PBS-iniezione. Al contrario, i regolatori infiammatori IL-6 e IL-8 e il fattore pro-angiogenesi VEGF sono stati fortemente indotti a livello trascrizionale entro 24-48 ore dalla microiniezione di E. coli. La secrezione di IL-6, IL-8 e VEGF è aumentata nel tempo, raggiungendo un picco di 5-9 giorni dopo l’associazione dell’E. coli rispetto ai controlli iniettati con PBS (Figura 2E). Presi insieme, questi dati dimostrano una risposta trascrizionale su larga scala e dipendente dal tempo all’associazione di E. col i con distinti modelli di espressione genica e secrezione di proteine in fase precoce e tardiva.

La colonizzazione batterica determina un aumento transitorio della proliferazione epiteliale e della maturazione degli enterociti

Mentre l’analisi trascrizionale ha dimostrato forti cambiamenti dipendenti dal tempo nelle cellule che compongono l’HIO a seguito della colonizzazione di E. coli, abbiamo ipotizzato che l’esposizione ai batteri può anche alterare il comportamento cellulare e / o la composizione dell’HIO. Studi precedenti hanno dimostrato che la colonizzazione batterica promuove la proliferazione epiteliale in organismi modello(Bates et al., 2006; Cheesman et al., 2011; Neal et al., 2013; Kremer et al., 2013; Ijssennagger et al., 2015). Abbiamo esaminato la proliferazione epiteliale negli IO su un arco di tempo di 96 ore trattando gli IO con una singola esposizione di 2 ore di 10 μM EdU aggiunti ai terreni di coltura da 22 a 24 ore dopo la microiniezione con 104 CFU E. coli o PBS da soli. HIOs sono stati successivamente raccolti per immunoistochimica a 24, 48, e 96 ore dopo la microiniezione(Figura 3). Il numero di cellule epiteliali proliferanti (Edu + + e E-caderina +) è stato elevato di ben tre volte in E. coli colonizzato HIO rispetto ai PBS trattati con PBS a 24 ore(Figura 3A-B). Tuttavia, a 48 ore dopo la microiniezione, la proporzione di cellule epiteliali EdU + è stata significativamente diminuita in E. coli colonizzato HIOs rispetto al controllo HIOs trattati trattati. Questa osservazione è stata supportata da un altro marcatore di proliferazione, KI67 (Gerdes et al., 1984)(Figura 3B), così come RNA-seq dati che dimostrano una soppressione complessiva dei geni del ciclo cellulare in E. col i colonizzato HIOs HIOs relativi a PBS-iniezione HIOs a 48 ore post-microiniezione(Figura 3-figure supplemento 1). Da 96 ore dopo la microiniezione la proporzione di cellule epiteliali EdU + era quasi identica in E. coli e PBS-IOs trattati con PBS (Figura 3B). Collettivamente, questi risultati suggeriscono che la colonizzazione di E. col i è associata ad una rapida esplosione di proliferazione epiteliale, ma che relativamente poche delle cellule figlie risultanti sono conservati successivamente all’interno dell’epitelio.

Il fattore di trascrizione Sox9 è espresso da cellule progenitrici nell’epitelio intestinale murino (Bastideet al., 2007; Mori-Akiyama et al., 2007), e diversi sottotipi epiteliali sono derivati da una popolazione di progenitori Sox9-espressiva nell’epitelio intestinale maturo (Bastide et al., 2007; Furuyama et al., 2011). Abbiamo esaminato l’espressione SOX9 in HIOs a seguito di microiniezione con E. coli o PBS da sola su un corso di 96 ore(Figura 3C). Negli HIO trattati con PBS, la maggior parte delle cellule epiteliali ha mostrato una robusta espressione nucleare SOX9 in tutti i punti temporali esaminati. Tuttavia, l’espressione SOX9 è stata drasticamente ridotta in E. coli colonizzato HIOs a 48-96 ore dopo la microiniezione ed è stato notevolmente distribuito in nuclei più lontano dal lume e adiacente al mesenchima sottostante, rispecchiando la distribuzione alterata di EdU + nuclei visto in Figura 3B. Questa osservazione suggerisce che vi è una riduzione del numero di cellule progenitrici nell’epitelio HIO a seguito della colonizzazione di E. coli e implica che altri tipi di epitelio possono rappresentare una maggiore proporzione dell’epitelio HIO in punti successivi post-colonizzazione. Non abbiamo visto alcuna colorazione apprezzabile per le cellule epiteliali che esprimono il calice, Paneth, o marcatori cellulari enteroendocrini (MUC2, DEFA5, e CHGA, rispettivamente; dati negativi non mostrati). Tuttavia, l’espressione del piccolo intestinale pennello confine enzima dipeptidyl peptidase-4 (DPPIV) è stato trovato per essere robustly espresso nel E. coli colonizzato HIOs a 48 e 96 ore post-microiniezione(Figura 3D). La DPPIV non è stata rilevata in nessuno degli IIO iniettati con PBS in nessun punto temporale. Il lisozima (LYZ), un enzima antimicrobico espresso dai progenitori di Paneth-like nelle cripte intestinali piccole Bevins e Salzman (2011), è stato ampiamente distribuito nell’epitelio degli IO trattati con PBS come abbiamo descritto in precedenza (Spenceet al., 2011) (Figura 3D). Tuttavia, negli IIO con colonizzazione di E. coli, l’espressione LYZ era limitata a distinti cluster di cellule epiteliali e, in particolare, non si è mai sovrapposta alla colorazione DPPIV(Figura 3D). Dato che i marcatori Paneth Cell bona f ide (cioè DEFA5) non sono stati osservati in nessun HIO, è probabile che l’espressione LYZ stia segnando una popolazione di cellule simile a quella dei progenitori. Presi insieme, questi esperimenti indicano che la colonizzazione di E. coli induce un sostanziale ma transitorio aumento del tasso di proliferazione epiteliale seguito da una riduzione e ridistribuzione dei progenitori epiteliali proliferanti e la differenziazione di una popolazione di cellule che esprimono gli enzimi del boarder degli enterociti del piccolo intestino per un periodo di 2-4 giorni.

La colonizzazione di E. coli è associata ad una riduzione di O2 luminale

L’epitelio intestinale maturo è caratterizzato da un forte gradiente di ossigeno, che va dall’8% di ossigeno all’interno della parete intestinale a <2% di ossigeno nel lume dell’intestino tenue (Fisheret al., 2013). La riduzione del contenuto di ossigeno nel lume intestinale si verifica durante il periodo perinatale immediato(Gruette et al., 1965), con conseguenti cambiamenti nella fisiologia epiteliale(Glover et al., 2016; Kelly et al., 2015; Colgan et al., 2013; Zeitouni et al., 2016) che contribuisce a plasmare la successiva composizione del microbiota(Schmidt e Kao, 2014; Espey, 2013; Albenberg et al., 2014; Palmer et al., 2007; Koenig et al., 2011). L’analisi della risposta globale trascrizionale all’associazione dell’E. coli nel tessuto intestinale immaturo ha rivelato cambiamenti pronunciati e coordinati nell’espressione genica coerenti con l’insorgenza dell’ipossia(Figura 2C-E). Abbiamo quindi misurato la concentrazione di ossigeno nel lume di controllo HIOs e dopo microiniezione di E. col i vivo utilizzando un optodo di fibra ottica di 50 micron di diametro (Figura 4A-B). Concentrazione di ossigeno di base nel lume dell’organoide era 8,04 ± 0,48%, che è stato significativamente ridotto rispetto ai mezzi di coltura esterni (18,86 ± 0,37%, p = 3,6 × 10-11). A 24 e 48 ore dopo la microiniezione, la concentrazione di ossigeno luminale è stata significativamente ridotta in E. coli-injected HIOs rispetto a PBS-iniezione HIOs (p = 0,04 e p = 5,2 × 10-05, rispettivamente) raggiungendo concentrazioni fino a 1,67 ± 0,62% a 48 ore (Figura 4A). E. coli HIO iniettati sono stati raccolti e CFU sono stati enumerati dal contenuto luminale a 24 e 48 ore dopo la microiniezione. Abbiamo osservato una correlazione negativa altamente significativa tra CFU luminale e la concentrazione di ossigeno luminale dove una maggiore densità di batteri luminali è stata correlata con concentrazioni di ossigeno più basse (r2 = 0,842, p = 6,86 × 10-5; Figura 4B). Infine, al fine di valutare l’ossigenazione relativa nell’epitelio stesso, abbiamo utilizzato una piccola molecola pimonidazolo (PMDZ), che forma coniugati covalenti con gruppi tiolici su proteine citoplasmatiche solo in condizioni di basso ossigeno(Arteel et al., 1998). L’immunochimica fluorescente ha dimostrato un maggiore assorbimento di PMDZ nell’epitelio HIO associato all’E. coli, e negli HIO cresciuti nell’1% di O2 come controllo positivo rispetto agli HIO iniettati con PBS, o HIO iniettati con calore ucciso E. coli a 48 ore dopo la microiniezione(Figura 4C). Così, l’ossigeno luminale ed epiteliale è ridotto a seguito di microiniezione di E. col i nell’HIO, coerente con i dati nei topi che mostrano che l’epitelio in vivo è in un simile stato di basso ossigeno in condizioni fisiologiche normali(Schmidt e Kao, 2014; Kelly et al., 2015; Kim et al., 2017).

NF-κB integra stimoli microbici complessi e ipossici

La colonizzazione diE. coli provoca una robusta risposta trascrizionale nel tessuto intestinale immaturo(Figura 2) che è associata all’insorgenza dell’esaurimento dell’ossigeno luminale e della relativa ipossia tissutale(Figura 4). Ci siamo posti l’obiettivo di determinare se possiamo assegnare porzioni della risposta trascrizionale all’interazione diretta con i microbi o al successivo esaurimento dell’ossigeno luminale. Nell’analisi RNA-seq(Figura 2), la segnalazione NF-κB è emersa come una delle principali vie coinvolte in questa complessa interazione ospite-microbo, e NF-κB ha dimostrato da altri di agire come mediatore trascrizionale sia del contatto microbico che della risposta all’ipossia tissutale (Rius et al., 2008; Gilmore, 2006; Wullaert et al., 2011). L’ontologia genica e l’analisi del percorso di REACTOME hanno mostrato che i componenti di segnalazione NF-κB sono anche altamente up-regolati a seguito di microiniezione di E. coli in HIO (Figura 2C e Figura 5-figure supplement 1A). Così, abbiamo valutato il ruolo della segnalazione NF-κB nella risposta trascrizionale associata al contatto microbico e la risposta associata all’ipossia utilizzando l’inibitore altamente selettivo dell’IKKβ SC-514 (Kishoreet al ., 2003; Litvak et al., 2009) per inibire la fosforilazione e l’attivazione del fattore di trascrizione p65 (Figura 5-figuresupplement 1B). Un’altra serie di HIO è stata contemporaneamente trasferita in una camera ipossica e coltivata in 1% di O2 con e senza SC-514. A 24 ore dopo il trattamento, gli HIO sono stati raccolti per l’isolamento dell’RNA e l’RNA-seq. Abbiamo ideato uno schema sperimentale che ci ha permesso di analizzare i contributi relativi di contatto microbico e ipossia luminale microbica associata a ipossia nella risposta trascrizionale all’associazione con E. coli vivo(Figura 5A e Figura 5-figure supplement 1C). In primo luogo, abbiamo identificato un insieme di geni significativamente up-regolato (log2FC > 0 e FDR-adjusted p-value < 0,05) per microiniezione di E. coli vivo o di calore inattivato E. coli (geni dipendenti da contatto ). Da questo set di geni, abbiamo identificato un sottoinsieme che è stato soppresso dalla presenza dell’inibitore NF-κB SC-514 durante l’associazione con E. coli vivo o termoinattivato (log2FC < 0 e FDR-adjusted p-value < 0.05; Gene Set I, Figura 5B). Quindi, Gene Set I rappresenta la risposta trascrizionale dipendente da NF-κB alla E. coli viva o morta. I geni indotti da E. col i vivi o inattivati dal calore ma non soppressi da SC-514 sono stati considerati indipendenti da NF-κB (Gene Set III, Figura 5B). Allo stesso modo, abbiamo confrontato i geni comunemente up-regolati per associazione con E. coli vivo e quelli up-regolati in condizioni di cultura 1% O2. Un sottoinsieme di geni indotti da colture di E. col i vivo o di O2 all’1% ma soppressi dalla presenza dell’inibitore NF-κB è stato identificato come risposta trascrizionale NF-κB-dipendente dall’ipossia associata all’ipossia (Gene Set II, Figura 5B) . I geni indotti dall’E. coli vivo o dall’ipossia ma non inibiti dalla presenza dell’inibitore NF-κB sono stati considerati risposte trascrizionali indipendenti da NF-κB all’ipossia associata al microbo (Gene Set IV). Gli elenchi dei geni per ogni set di geni si trovano nel file supplementare 1.

In seguito all’identificazione di questi quattro insiemi di geni, abbiamo poi applicato l’analisi della sovrarappresentazione utilizzando i database dei percorsi GO e REACTOME per identificare i percorsi arricchiti per ciascuno dei quattro insiemi di geni, ottenendo quattro modelli chiaramente distinguibili di arricchimento dei percorsi genici(Figura 5C). Il contatto con l’E. coli vivo o attivato dal calore è sufficiente a promuovere l’espressione dei geni coinvolti nel mantenimento dell’integrità della barriera epiteliale e nella produzione di mucina, un effetto che viene soppresso in presenza dell’inibitore NF-κB. Inoltre, i principali percorsi di sviluppo, tra cui la morfogenesi epiteliale, lo sviluppo del tratto digestivo e l’espressione degli enzimi digestivi, sembrano essere guidati principalmente dall’associazione batterica e sono in gran parte dipendenti da NF-κB. Una robusta difesa innata e adattiva richiede sia il contatto batterico che l’ipossia, con alcuni geni associati all’elaborazione dell’antigene e alla segnalazione delle citochine che sono dipendenti da NF-κB (Gene Set II) e altri associati a set di geni NF-κB-independenti (Gene Set III e IV). I geni associati ai peptidi antimicrobici defensinici sono stati arricchiti solo nel set di geni NF-κB-dipendenti dall’ipossia (Gene Set IV), suggerendo che i peptidi antimicrobici sono regolati da meccanismi che sono distinti da altri aspetti dell’integrità della barriera epiteliale come le mucine e le giunzioni epiteliali (Gene Set I). I componenti di segnalazione TLR sono stati ampiamente potenziati dall’E. coli vivo e associati sia al contatto microbico che all’ipossia erano in gran parte indipendenti da NF-κB (Gene Set III e IV). C’era una notevole firma trascrizionale che suggeriva un adattamento metabolico e mitocondriale ai batteri che era indipendente da NF-κB e principalmente guidato dal contatto batterico piuttosto che dall’ipossia (Gene Set III).

Per interrogare i cambiamenti trascrizionali influenzati dall’esposizione a SC-514, abbiamo esaminato i set di geni sovrarappresentati dai database GO e REACTOME in geni che erano significativamente up- o down-regolati dal trattamento con SC-514 da solo(Figura 5-figure supplement 1C e D) . In particolare, SC-514 da solo non sembra avere un forte effetto sui percorsi identificati nella Figura 5C come risposte chiave NF-κB-dipendenti dal contatto batterico e/o ipossia. In Figura 5-figure supplement 1E, abbiamo esaminato il grado di sovrapposizione tra Gene Set I, Gene Set II, e l’insieme dei geni che sono significativamente down-regolati in PBS-injected HIOs trattati con SC-514. Questa analisi dimostra che la maggior parte dei geni del Set I e del Set II non sono significativamente down-regolati negli IO iniettati in PBS trattati con SC-514. Gli effetti più significativi di SC-514 solo tra i geni del Set I e del Set II sono legati al metabolismo, allo stato redox e alla dinamica ribosomica(Figura 5-figure supplement 1F). Quindi, l’effetto di SC-514 da solo non può spiegare i cambiamenti NF-κB-dipendenti nella difesa innata e adattiva, l’integrità della barriera epiteliale, l’angiogenesi e la segnalazione dell’ipossia, o lo sviluppo intestinale a seguito di contatto batterico e/o ipossia durante la colonizzazione.

Infine, abbiamo anche esaminato il ruolo del contatto microbico e ipossia indotta da colonizzazione cambiamenti indotti in AMP, citochina, e la secrezione del fattore di crescita utilizzando ELISA(Figura 5-figure supplemento 2). Coerentemente con i risultati dei dati RNA-seq, questi risultati indicano che ci sono diverse risposte al contatto batterico e ipossia. Abbiamo osservato casi in cui le citochine sono state indotte da contatto microbico o ipossia da sola (IL-6), altri casi in cui l’ipossia sembrava essere lo stimolo dominante (BD-1), e un terzo paradigma normativo in cui la risposta all’E. coli vivo risulta evidentemente dall’influenza cumulativa del contatto batterico e dell’ipossia (BD-2, IL-8, VEGF). Presi insieme, questa analisi dimostra che l’associazione dell’epitelio intestinale immaturo con l’E. coli vivo si traduce in un’interazione complessa tra contatto microbico e ipossia microbica associata all’espressione genica indotta da ipossia e alla secrezione di proteine.

La colonizzazione batterica favorisce la secrezione di peptidi antimicrobici

I peptidi antimicrobici (AMP) sono effetti chiave per la difesa innata delle superfici epiteliali(Muniz et al., 2012) e agiscono per inibire la crescita microbica attraverso la lisi diretta della parete cellulare batterica e la modulazione del metabolismo batterico(Ganz, 2003; Bevins e Salzman, 2011; O’Neil e O’Neil, 2003; Vora et al., 2004; Brogden, 2005). L’espressione del gene Defensin è altamente up-regolata a seguito di microiniezione di E. coli in HIO(Figure 2D-E e e 4C). Utilizzando un database di AMP noti(Wang et al., 2016) per interrogare i nostri set di dati RNA-seq, abbiamo scoperto che diversi AMP sono up-regolati nell’epitelio intestinale immaturo dopo l’associazione di E. coli (Figura 6A). Tra questi, DEFB4A e DEFB4B, geni duplicati che codificano il peptide umano β-defensina 2 (Harderet al., 1997), sono stati i più altamente regolati; altri AMP indotti dall’associazione di E. coli includono i peptidi multifunzionali CCL20, CXCL2, CXCL1, CXCL6, CXCL3, REG3A (Cashet al., 2006), e LTF (Figura 6A). L’analisi dei dati RNA-seq da HIOs microiniettato con E.coli vivo o ucciso a caldo con e senza inibitore NF-κB o coltura di HIOs in condizioni di ipossia aveva indicato che i geni della defensina erano stati arricchiti tra l’insieme dei geni NF-κB-indipendenti indotti dall’ipossia (Figura 5C). Abbiamo esaminato l’espressione DEFB4A in particolare(Figura 6B) e abbiamo trovato che rispetto al trattamento di controllo, microiniezione di E. coli vivo ha portato ad un aumento di 7,38 volte l’espressione DEFB4A normalizzata. Coerentemente con l’idea che l’espressione del DEFB4A è indotta da ipossia e non dipende dalla segnalazione di NF-κB, gli IO trattati con inibitore di NF-κB iniettati con E. coli mostravano ancora un aumento di ~ 8 volte nell’espressione genica e gli IO coltivati per ipossia mostravano un’induzione di ~ 5,5 volte (Figura 6B). D’altra parte, microiniezione con calore inattivato E. coli ha portato a induzione DEFB4A che era significativamente inferiore rispetto alla microiniezione con E. coli vivo (p = 0,007. Un modello simile di espressione è stato osservato per il DEFB4B(Figura 6-figure supplement 1).

Abbiamo anche esaminato la secrezione di β-defensina 2 peptide umano (BD-2) nel supernatante di E. coli-associati HIOs (Figura 2E e Figura 6C). BD-2 secrezione è stata aumentata 3,4 volte a 24 ore dopo la microiniezione di E. coli (p = 2,7 × 10-8). Tuttavia, l’inattivazione termica dell’E. coli o l’aggiunta di inibitore NF-κB ha portato alla soppressione della secrezione di BD-2 rispetto all’E. coli vivo (p=0,00051 e 1,6 × 10-6,^{rispettivamente)}.

Per determinare se i livelli di BD-2 prodotto da HIO e secreto nei media erano sufficienti a ritardare la crescita batterica, abbiamo testato l’effetto del BD-2 a concentrazioni che ricapitolano lo stato di base nel HIO (~ 0,1 μg/ml) e dopo microiniezione con E.coli (~ 1 μg/ml ) sulla crescita in vitro di E. coli oltre 18 ore (Figura 6D). Anche se c’era poco effetto sulla densità di E. coli durante la crescita iniziale log-fase, BD-2 ha ridotto la quantità di tempo i batteri spesi in fase di crescita log-fase, e la densità di E. coli è stata significativamente diminuita nel tempo in mezzi di crescita batterica integrato BD-2 (p = 0,001), con conseguente significativa diminuzione della capacità effettiva di carico in vitro, o densità massima della popolazione(Figura 6E, p = 8 × 10-4). Inoltre, le concentrazioni di BD-2 coerente con quelli trovati in HIO / E. coli supernatante (1 mg / ml) è stato significativamente più inibitorio di bassa concentrazione BD-2 (0,1 mg / ml) nel nostro test di crescita in vitro (p = 0,013). Ulteriori dati suggeriscono che l’attività inibitoria del BD-2 in vitro non è specifica per l ‘E. coli str. ECOR2 e dipende dal mantenimento della struttura della proteina BD-2, poiché il BD-2 inibisce in modo simile la crescita di E. coli str. K12, e il BD-2 inattivato dal calore ha perso questi effetti inibitori(Figura 6-figure supplement 2). Da questa serie di esperimenti, si conclude che la colonizzazione dell’E. coli promuove una migliore espressione delle AMP, compreso il BD-2, a concentrazioni sufficienti a sopprimere la crescita microbica.

La colonizzazione batterica favorisce l’espressione delle mucine epiteliali e delle glicotransferasi

Le mucine sono una componente essenziale dell’integrità epiteliale, fungendo da formidabile barriera all’invasione microbica e da deposito per gli AMP secreti(Bergstrom e Xia, 2013; Cornick et al., 2015; Johansson e Hansson, 2016; Kim e Ho, 2010). La sintesi di mucina richiede una serie complessa di modifiche post-traslazionali che aggiungono catene laterali di carboidrati ad alto peso molecolare alla proteina della mucina del nucleo(Varki, 2017). I nostri dati RNA-seq suggeriscono che l’espressione del gene della mucina dipende sia dal contatto batterico che dalla segnalazione NF-κB (Figura 5C). Pertanto, abbiamo esaminato l’espressione dei geni nel controllo e E. coli HIO microiniettato che codificano le proteine del nucleo della mucina così come le glicotransferasi che generano l’ampia varietà di modifiche della mucina post-traslazionale(Figura 7A). Sebbene alcune glicotransferasi siano state aumentate a 24 ore dopo la microiniezione di E. coli, l’espressione delle proteine del nucleo della mucina e molte glicotransferasi hanno raggiunto i livelli di picco a 48 ore dopo l’introduzione di E. coli nel lume dell’HIO(Figura 7A). Periodico Acido-Schiff e colorazione blu alciana (PAS/AB) di sezioni prese da HIO a 48 ore dopo la microiniezione di E. coli rivelano la formazione di un robusto strato di mucina sulla superficie epiteliale apicale composto sia acida (AB-positivo) e neutro (PAS-positivo) componenti glicoproteine, suggerendo una ricca matrice di O-linked mucine, glicosaminoglicani e proteoglicani(Figura 7B-C). È interessante notare che l’associazione di E. coli ha causato un’induzione iniziale di MUC5AC a 48 ore che è stata ridotta di 96 ore(Figura 7A). MUC5AC è più altamente espresso all’interno della mucosa gastrica, ma è stato riportato anche nell’epitelio duodenale(Buisine et al., 1998, 2001; Rodríguez-Piñeiro et al., 2013). D’altra parte, MUC2 è più comunemente associato con il duodeno, ed è aumentato più lentamente, mostrando l’espressione di picco dopo 96 ore di associazione con E. coli(Figura 7A). La co-colorazione degli IO di controllo e degli IO microiniettati con E. col i ha dimostrato la colocalizzazione con l’Ulex europaeus agglutinina I (UEA1), una lectina ad alta specificità per la frazione terminale del fucosio Fucα1-2Gal-R (Figura 7D). Ciò suggerisce che in seguito all’associazione di E. coli, gli IO producono mucine con modificazioni dei carboidrati associate alla colonizzazione batterica in vivo(Cash et al., 2006; Hooper et al., 1999; Goto et al., 2014).

RNA-seq dati suggeriscono che le mucine O-linked mucine erano altamente arricchito tra il sottoinsieme dei geni indotti da contatto batterico in un sottoinsieme di geni indotta da contatto batterico in un NF-κB-dipendente modo (Figura 5). Abbiamo esaminato questo fenomeno a livello di singoli geni glicosiltransferasi e mucina(Figura 7E). La trascrizione indotta da E. coli di mucine e glicosiltransferasi(Figura 7E) e la secrezione di mucina(Figura 7-figure supplement 1) è stata soppressa in presenza dell’inibitore NF-κB SC-514. Inoltre, la coltura di HIO in condizioni di ipossia non è stata sufficiente a promuovere la trascrizione dei geni coinvolti nella sintesi della mucina(Figura 7E). Questo risultato è stato confermato con la colorazione PAS/AB di HIOs microiniettato con PBS, E. coli vivo o termoinattivato, o coltivato in condizioni di ipossia per 24 ore, dove il contatto batterico ha favorito la formazione di uno strato di muco, mentre la microiniezione di PBS o la coltura in condizioni di ipossia non lo ha fatto(Figura 7F). Presi nel loro insieme, questi risultati indicano che l’associazione dell’epitelio intestinale immaturo con l’E. coli promuove una robusta secrezione di muco attraverso un meccanismo dipendente da NF-κB e che l’ipossia da sola non è sufficiente a ricapitolare la produzione di muco indottadall’E. coli.

La segnalazione NF-κB è necessaria per il mantenimento dell’integrità della barriera a seguito della colonizzazione batterica

Avendo stabilito che l’epitelio intestinale immaturo in HIO(Figura 1-figure supplement 1) può essere stabilmente associato con E. coli non patogeno ( Figura1), con conseguenti ampi cambiamenti nell’attività trascrizionale (Figura2) e portando ad un’elevata produzione di AMP (Figura6) e alla secrezione di muco epiteliale (Figura7), abbiamo ipotizzato che questi cambiamenti nell’espressione genica e proteica avrebbero conseguenze funzionali per la barriera epiteliale immaturo. L’analisi RNA-seq ha dimostrato un’ampia up-regolazione della trascrizione nei geni coinvolti nella formazione della giunzione aderente e altre interazioni cellula-cellula in HIO dopo la microiniezione con E. coli vivo che è stato inibito in presenza di NF-κB inibitore SC-514 (Figura 8A). Abbiamo utilizzato un test di permeabilità FITC-dextran modificato(Leslie et al., 2015) e l’imaging in tempo reale di culture HIO vivo per misurare la funzione di barriera epiteliale in HIO microiniettato con PBS, E. coli vivo, o vivo E. coli+SC-514 a 24 ore dopo la microiniezione (Figura 8B). Mentre gli HIO microiniettati con PBS o E. coli hanno mantenuto il 94,1 0,3% della fluorescenza FITC-dextran durante il periodo di saggio di 20 ore, gli HIO microiniettati con E. coli in coltura in presenza di SC-514 hanno mantenuto solo il 45,5 ± 26,3% del segnale fluorescente (p=0,02; Figura 8B). Abbiamo anche misurato il tasso di traslocazione batterica attraverso l’epitelio HIO, che ha portato a mezzi di coltura contaminati(Figura 8C). HIO microiniettato con E. coli e trattato con SC-514 sono stati confrontati con E. coli microiniettato HIO trattati con veicolo (controlli DMSO) e PBS microiniettato controlli in 7 giorni in coltura. Gli IO associati con E. coli +SC-514 hanno mostrato una rapida insorgenza di traslocazione batterica entro 2-3 giorni, con la traslocazione batterica rilevata nel 96% degli IO trattati con SC-514 entro il giorno 7 rispetto al 23% degli IO microiniettati con E. coli e trattati con DMSO (P=<2 × 10-16; Figura 8C). Pertanto, bloccando la segnalazione NF-κB inibito la maturazione barriera epiteliale barriera con conseguente aumento della traslocazione batterica durante l’associazione E. coli con l’epitelio immaturo.

La colonizzazione batterica promuove la resilienza della barriera epiteliale durante la sfida citochina

Infine, abbiamo saggiato la funzione di barriera epiteliale in circostanze che ricapitolano l’infiammazione fisiologica. TNFα e IFNγ sono citochine chiave che mediano l’attività innata e adattativa delle cellule immunitarie nell’intestino (Turner,2009) durante l’infezione batterica (Rhee et al.,2005; Emami et al., 2012) e in enterocolite necrotizzante (Tan et al.,1993; Ford et al., 1996, 1997; Halpern et al., 2003; Upperman et al., 2005). La combinazione di TNFα e IFNγ è stata precedentemente dimostrata per indurre la permeabilità di barriera in modo dose-dipendente nelle colture epiteliali Transwell (Wang et al., 2005; Wang et al., 2006). Così, gli HIO sono stati microiniettati con PBS o E. coli vivo e coltivato per 24 ore e sono stati successivamente microiniettato con FITC-destrano e trattati con PBS o un cocktail di TNFα e IFNγ aggiunto ai mezzi esterni per esporre l’epitelio basolaterale (Figura 8D). Perdita di FITC-destrano fluorescenza è stata osservata utilizzando live-imaging e ha indicato che il trattamento con TNFα e IFNγ da solo ha portato ad una rapida e sostenuta diminuzione della fluorescenza luminale rispetto al PBS o E. coli iniettato HIOs (p = 5 × 10-4, Figura 8D). Tuttavia, HIOs associati con E. coli prima dell’aggiunta del TNFα e IFNγ cocktail mantenuto segnale fluorescente significativamente più rispetto al trattamento con TNFα e IFNγ solo (p = 0,042, Figura 8D). Abbiamo esaminato l’espressione e la distribuzione della proteina di giunzione stretta ZO-1, e la proteina basale-laterale E-caderina (ECAD) nelle sezioni istologiche prese da PBS e E. coli-associati HIOs sottoposti a trattamento TNFα e IFNγ (Figura 8E). Rispetto ai controlli, lo strato epiteliale è altamente disorganizzato in HIO trattati con TNFα e IFNγ, con colorazione citoplasmatica ZO-1 e ECAD disorganizzato. Al contrario, HIOs associati con E. coli prima del trattamento TNFα e IFNγ mantenere e organizzato epitelio colonnare epitelio con robusta apicale ZO-1 e correttamente localizzato colorazione ECAD (Figura 8E). Allo stesso modo, la corretta localizzazione di ulteriori marcatori aggiuntivi di barriera epiteliale integrità occludina (OCLN) e acetilato-tubulina sono conservati in HIO associati con E. coli durante il trattamento TNFα e IFNγ rispetto ai HIO trattati con TNFα e IFNγ solo (Figura 8-figuresupplemento 1).Questi risultati suggeriscono che la colonizzazione dell’epitelio immaturo con E. coli risultati in un epitelio che è più robusto per sfidare da citochine infiammatorie potenzialmente dannose.

Discussione

Il lavoro qui presentato dimostra che gli IO rappresentano un robusto sistema modello per studiare le interazioni iniziali tra l’epitelio gastrointestinale e i microbi colonizzatori che si verificano nell’immediato periodo postnatale. I microrganismi introdotti nel tratto digestivo alla nascita stabiliscono una relazione intima e mutualistica con l’ospite nel tempo(Costello et al., 2012; Palmer et al., 2007; Koenig et al., 2011; Bäckhed et al., 2015; Wopereis et al., 2014). Tuttavia, l’espansione delle popolazioni batteriche nell’intestino rappresenta anche una sfida importante per l’omeostasi intestinale attraverso l’esposizione a MAMP potenzialmente infiammatori(Tanner et al., 2015; Renz et al., 2011), il consumo di ossigeno dei tessuti(Glover et al.,2016; Espey, 2013; Albenberg et al., 2014), la digestione della barriera mucosa(Marcobal et al., 2013; Desai et al., 2016) e la competizione per i substrati metabolici(Rivera-Chávez et al., 2016; Kaiko et al., 2016 ). L’epitelio intestinale maturo funge da barriera cruciale per i microbi che abitano le superfici del lume e delle mucose(Artis, 2008; Turner, 2009; Desai et al., 2016; Kelly et al., 2015; Cornick et al., 2015; Peterson e Artis, 2014; Hackam et al., 2013; Turner, 2009). La funzione specifica dell’epitelio nell’adattarsi alla colonizzazione microbica iniziale, indipendente dal sistema immunitario innato e adattivo, rimane poco chiara a causa della mancanza di sistemi modello appropriati che ricapitolino il mutualismo microbico ospite. Chiarire il ruolo dell’epitelio nella colonizzazione del tratto digestivo da parte dei microrganismi è essenziale per comprendere la base molecolare del mutualismo microbico ospite stabile nell’intestino maturo.

Per esaminare l’istituzione del mutualismo microbico ospite, abbiamo scelto di esaminare l’interazione tra l’epitelio immaturo degli HIO e un ceppo non patogeno di E. coli. Le enterobatteriacee, tra cui l ‘E. coli, sono abbondanti nell’intestino neonato(Palmer et al., 2007; Koenig et al., 2011; Bäckhed et al., 2015; DIABIMMUNE Study Group et al., 2016). Diverse indagini su larga scala sulla composizione microbica hanno dimostrato che l’E. coli è tra gli organismi più diffusi e abbondanti nei campioni di feci dei neonati(Bäckhed et al., 2015; Koenig et al., 2011) e nel meconio (Gosalbes et al.,2013). I ceppi non patogeni di E. coli possono rappresentare organismi modello ideali per esaminare l’impatto della colonizzazione batterica dell’epitelio immaturo a causa della loro prevalenza nella popolazione neonatale e della loro rilevanza per la colonizzazione naturale, la caratterizzazione estesa e la facilità di manipolazione in laboratorio . Microiniezione di E. coli non patogeni nel lume di HIOs ha portato a stabili, co-colture a lungo termine(Figura 1). E. coli cresce rapidamente all’interno del lume HIO(Figura 1), raggiungendo densità approssimativamente paragonabili alle popolazioni presenti nell’intestino tenue umano(Donaldson et al., 2016) entro 24 ore. Inoltre, l’HIO è in grado di sostenere questa popolazione microbica interna per diversi giorni mantenendo l’integrità della barriera epiteliale(Figura 1). Questa osservazione è implicita nella conclusione che l’epitelio immaturo, insieme ad uno strato mesenchimale poco strutturato, è intrinsecamente in grado di adattarsi alle sfide imposte dalla colonizzazione con batteri intestinali non patogeni.

Per esaminare più da vicino questi adattamenti epiteliali della colonizzazione microbica, abbiamo eseguito un’analisi trascrizionale di questa risposta. Gli IO colonizzati da E. coli mostrano una diffusa attivazione trascrizionale di vie di riconoscimento batterico innate, comprese le cascate di segnalazione TLR e i mediatori a valle come NF-κB (Figura 2). La composizione cellulare dell’epitelio HIO è raffinato dopo la colonizzazione di E. col i, con un rapido ma transitorio aumento della proliferazione epiteliale che precede una riduzione generale del numero di cellule progenitrici epiteliali immature e l’emergere di enterocyte maturi che esprimono enzimi digestivi bordo pennello bordo digestivo(Figura 3). Insieme, questi risultati suggeriscono che gli stimoli batterici esercitano un’ampia influenza sulla composizione molecolare e cellulare dell’epitelio immaturo.

Stimoli indiretti derivanti dall’attività microbica possono anche modellare la funzione epiteliale(Buffie e Pamer, 2013), e il trascrittoma di E. coli colonizzato HIO riflette una risposta cellulare alla ridotta disponibilità di ossigeno(Figura 2). La riduzione della concentrazione di O2 luminale si verifica nell’intestino neonatale(Gruette et al., 1965; Fisher et al., 2013; Zheng et al., 2015), forse come risultato del consumo di O2 disciolto dai batteri anaerobi anaerobi anaerobici e facoltativi che predominano nel microbioma intestinale nei primi anni di vita(Espey, 2013; Fanaro et al., 2003; Favier et al., 2002; Palmer et al., 2007), e l’epitelio intestinale maturo è ipossico rispetto alla lamina propria sottostante a causa della stretta vicinanza al contenuto anaerobico luminoso(Glover et al., 2016; Kelly et al., 2015; Zheng et al., 2015). Abbiamo misurato il contenuto di ossigeno luminale e l’ipossia epiteliale in HIO microiniettato con E. coli vivo, trovando che la concentrazione di ossigeno luminale è ridotta più di 10 volte rispetto ai media circostanti. Questo stato di ipossia relativa si estende nell’epitelio stesso ed è correlato con l’aumento della densità microbica(Figura 4). Così, anche se gli IO non hanno la rete di capillari che svolgono un ruolo essenziale nella fornitura di ossigeno dei tessuti nell’intestino, gli IO di E. coli-colonizzati ricapitolano in vitro il gradiente di ossigeno presente nell’interfaccia epiteliale.

La colonizzazione dell’HIO da parte di E. coli comprende quindi due ampi stimoli: l’esposizione immediata a segnali mediati da contatto come i MAMP, e l’insorgenza di ossigeno luminale limitante e ipossia epiteliale. Sebbene il potenziale significato dell’esposizione a prodotti microbici nel contesto dell’ipossia tissutale sia ampiamente riconosciuto nell’ambito dell’enterocolite necrotizzante(Tanner et al., 2015; Afrazi et al., 2014; Hackam et al., 2013; Neu e Walker, 2011; Upperman et al., 2005; Nanthakumar et al., 2011), questo paradigma di segnalazione dei due fattori non è stato ben studiato come componente della normale colonizzazione e sviluppo intestinale. Utilizzando il sistema di modello HIO, è stato possibile progettare esperimenti che esaminano separatamente l’impatto relativo dei segnali microbici mediati per contatto da segnali ipossici associati a microbici(Figura 5 e Figura 5-figure supplement 2). Questo approccio rivela che la risposta trascrizionale completa generata dall’HIO dopo la colonizzazione di E. coli è il prodotto sia di segnali dipendenti dal contatto che di segnali dipendenti dall’ipossia, con E. coli o ipossia inattivati dal calore che ricapitolano da soli sottoinsiemi distinti dei cambiamenti nell’espressione genica osservati negli HIO colonizzati con E. col i vivi(Figura 5). Studi futuri potranno esaminare il ruolo di ulteriori stimoli microbici associati all’ipossia indipendenti dall’ipossia, come i prodotti metabolici(Kaiko et al., 2016) e i MAMP associati alla viabilità(Sander et al., 2011), nel mediare la risposta epiteliale alla colonizzazione batterica iniziale.

La segnalazione di NF-κB è stata implicata nella risposta a valle sia ai segnali microbici mediati dal contatto (Zhange Ghosh, 2001; Xiao e Ghosh, 2005; Kawai e Akira, 2007) sia all’ipossia dei tessuti (Koong et al.,1994; Rius et al., 2008; Arias-Loste et al., 2015; Oliver et al., 2009; Zeitouni et al., 2016; Colgan et al., 2013; Grenz et al., 2012). L’inibizione farmacologica di NF-κB ha portato alla soppressione di entrambe le espressioni geniche microbiche associate al contatto e all’ipossia negli IO, inibendo sia le vie di difesa della barriera epiteliale mediata dal contatto che l’attivazione immunitaria associata all’ipossia (Figura 5). NF-κB sembra svolgere un ruolo chiave nell’integrazione degli stimoli complessi derivanti dall’esposizione a prodotti microbici e dall’insorgenza di ipossia localizzata nell’epitelio intestinale immaturo durante la colonizzazione batterica.

La maturazione molecolare e cellulare dell’intestino che si verifica durante l’infanzia si traduce in ultima analisi in una maggiore capacità funzionale(Lebenthal e Lebenthal, 1999; Sanderson e Walker, 2000; Neu, 2007). La colonizzazione batterica è associata a una maggiore funzione di barriera epiteliale negli animali gnotobiotici, compresi i cambiamenti nella produzione di peptidi antimicrobici e muco(Vaishnava et al., 2008; Cash et al., 2006; Goto et al., 2014; García-Lafuente et al., 2001; Malago , 2015; Ménard et al., 2008). Le difese prodotte nell’epitelio intestinale sono mediatori critici della densità e della composizione delle popolazioni microbiche nell’intestino e proteggono l’epitelio dall’invasione microbica(Kisich et al., 2001; Ostaff et al., 2013; Cullen et al., 2015; Salzman et al., 2003; Salzman et al., 2010). La produzione di BD-2 è drammaticamente aumentata negli IO subito dopo la colonizzazione dell’E. coli(Figura 2, Figura 5-figure supplement 2 e Figura 6), raggiungendo concentrazioni sufficienti a limitare la crescita eccessiva di E. coli (Figura 6 e Figura 6-figure supplement 2) senza precludere completamente la colonizzazione batterica potenzialmente benefica (Figura 1). Le mucine secrete e le mucine associate alla superficie cellulare formano una barriera fisica ai microbi nell’intestino, agiscono come serbatoi locali di peptidi antimicrobici e servono come substrati per la crescita di microrganismi benefici(Desai et al., 2016; Johansson e Hansson, 2016; Cornick et al., 2015; Hansson, 2012; Li et al., 2015; Dupont et al., 2014; Bergstrom e Xia, 2013). L’epitelio HIO immaturo produce un robusto strato di muco costituito da oligosaccaridi neutri e acidi con modificazioni terminali dei carboidrati a seguito della colonizzazione con E. coli(Figura 7). È importante notare che l’ipossia da sola non provoca la produzione di muco, mentre l’introduzione di E. col i inattivata dal calore induce la secrezione di muco in corrispondenza dell’epitelio apicale(Figura 7), suggerendo che il contatto microbico è lo stimolo principale che provoca la secrezione di muco negli HIO.

La permeabilità della barriera epiteliale è un importante parametro della funzione intestinale che riflette il grado di selettività nel trasferimento di nutrienti attraverso lo strato epiteliale e l’esclusione di batteri e altri materiali potenzialmente dannosi(Bischoff et al., 2014). Gli aumenti della permeabilità della barriera epiteliale si verificano nell’ambito dell’infiammazione(Ahmad et al., 2017; Michielan e D’Incà, 2015) e delle malattie infettive (Shawkie McCole ,2017). Colonizzazione di HIOs con E. coli risulta in una maggiore trascrizione dei geni associati alla formazione della giunzione aderente e altre interazioni cellula-cellula nell’epitelio(Figura 8). Tuttavia, l’inibizione della segnalazione di NF-κB aumenta drasticamente sia la permeabilità della barriera epiteliale che il tasso di traslocazione batterica (Figura 8), suggerendo che la segnalazione di NF-κB è fondamentale per mantenere l’integrità della barriera epiteliale dopo la colonizzazione. L’espressione dei geni coinvolti nella formazione della giunzione cellulare e la produzione di difese antimicrobiche e muco sono dipendenti da NF-κB (Figure6-8, Figura 7-figure supplement 1, Tsutsumi-Ishii e Nagaoka, 2002; Ahn et al., 2005). L’incapacità di montare un’efficace risposta di difesa innata in presenza dell’inibizione di NF-κB comporta il fallimento della barriera epiteliale HIO e la perdita di stabilità della co-cultura (Figura 8). Questo risultato sottolinea il ruolo critico della segnalazione di NF-κB nella formazione di un mutualismo ospite-microbo stabile all’interfaccia epiteliale immaturo.

La produzione disordinata di citochine pro-infiammatorie contribuisce alla perdita di integrità della barriera epiteliale in NEC(Tanner et al., 2015; Hackam et al., 2013; Neu e Walker, 2011; Nanthakumar et al., 2011; Halpern et al., 2003; Ford et al., 1997, 1996; Tan et al., 1993); questo è riassunto in HIO, in quanto l’esposizione a citochine pro-infiammatorie comporta la rapida perdita di integrità della barriera epiteliale e la dissoluzione delle giunzioni strette epiteliali(Figura 8). I probiotici possono promuovere l’integrità della barriera epiteliale in NEC(Robinson, 2014; Alfaleh et al., 2011; Underwood et al., 2014; Khailova et al., 2009) e gli IO colonizzati da E. coli mostrano una maggiore resilienza della barriera epiteliale(Figura 8). La maturazione funzionale derivante dalla colonizzazione dell’epitelio intestinale immaturo può quindi svolgere un ruolo essenziale nel promuovere la risoluzione dell’infiammazione fisiologica.

Mentre sono stati fatti grandi progressi nella caratterizzazione della composizione del microbiota intestinale in salute e malattia(Shreiner et al., 2015; Costello et al., 2012), questo approccio ha una limitata capacità di discernere i contributi dei singoli batteri alla creazione di simbiosi ospite-microbo. Il nostro lavoro stabilisce un approccio che ricapitola il mutualismo microbico ospite nell’intestino umano immaturo in un sistema di modelli in vitro sperimentalmente tracciabili. L’applicazione di questo approccio può facilitare lo sviluppo di modelli meccanicistici di interazioni microbiche ospite-microbiche nei tessuti umani in salute e nelle malattie. Per esempio, uno dei principali limiti nella nostra comprensione del NEC è stata la mancanza di un sistema modello appropriato per studiare la colonizzazione dell’intestino immaturo(Neu e Walker ,2011; Balimane e Chong, 2005; Tanner et al., 2015; Nguyen et al ., 2015). I nostri risultati suggeriscono che la colonizzazione dell’HIO con un batterio intestinale non patogeno porta alla maturazione funzionale della barriera epiteliale. I lavori futuri che esaminano gli effetti degli organismi associati all’intestino prematuro(Morrow et al., 2013; Greenwood et al., 2014; Ward et al., 2016) sulla maturazione molecolare, cellulare e funzionale dell’epitelio immaturo possono essere utili per chiarire i meccanismi di patogenesi della malattia associata a microbiota nell’intestino immaturo.

Materiali e metodi

Cultura HIO

Human ES cell line H9 (NIH registry #0062, RRID:CVCL_9773) è stato ottenuto dal WiCell Research Institute. Le cellule H9 sono state autenticate utilizzando Short Tandem Repeat (STR) DNA profiling(Matsuo et al., 1999) presso l’Università del Michigan DNA Sequencing Core ed esibivano un profilo STR identico alle caratteristiche STR pubblicate da(Josephson et al., 2006). La linea cellulare H9 era negativa per la contaminazione da micoplasma. Le cellule staminali sono state mantenute su Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) in mezzo mTeSR1 (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada). Le cellule staminali HESC sono state passate e differenziate in tessuto organolettico intestinale umano come descritto in precedenza(Spence et al., 2011; McCracken et al., 2011). Gli HIO sono stati mantenuti in mezzi contenenti EGF, Noggin e R-spondin (mezzi ENR, vedi[McCracken et al., 2011]) in 50 μl Matrigel (8 mg/ml) senza antibiotici prima degli esperimenti di microiniezione. Per gli esperimenti di coltura ipossica, gli HIO sono stati trasferiti in una camera di incubazione modulare idratata e sigillata (MIC-101, Billups-Rothenburg, Inc. Del Mar CA) riempita con 1% di O2, 5% di CO2, e il bilancio N2 e mantenuta a 37 per 24 ore.

Trapianto HIO e coltura di enteroidi derivati da tessuti

Trapianti HIO: Questo studio è stato eseguito in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Sanità. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall’Università del Michigan Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC; protocollo # PRO00006609). I trapianti HIO nella capsula renale sono stati eseguiti come descritto in precedenza(Finkbeiner et al., 2015; Dye et al., 2016) In breve, i topi sono stati anestetizzati con il 2% di isofluorano. Il fianco sinistro è stato sterilizzato con cloroesidina e alcool isopropilico, ed è stata praticata un’incisione per esporre il rene. HIOs sono stati inseriti manualmente in una tasca sottocapsulare del rene di maschio di 7-10 settimane NOD-SCID IL2Rgnull (NSG) topi usando il forcipe. Un lavaggio intraperitoneale di Zosyn (100 mg / kg; Pfizer Inc.) è stato somministrato prima della chiusura in due strati. I topi sono stati sacrificati e trapianto recuperato dopo 10 settimane. Tessuto umano: Normale, de-identificato tessuto intestinale fetale umano è stato ottenuto dal Laboratorio di Biologia dello Sviluppo dell’Università di Washington. Normale, de-identificato tessuto intestinale umano adulto intestinale è stato ottenuto da donatori di organi deceduti attraverso il Dono della Vita, Michigan. Tutti i tessuti umani utilizzati in questo lavoro sono stati ottenuti da donatori non viventi, sono stati de-identificati e sono stati condotti con l’approvazione dell’Università del Michigan IRB (protocollo # HUM00093465 e HUM00105750). L’isolamento e la coltura dell’epitelio HIO, l’epitelio HIO trapiantato, l’epitelio duodenale fetale e quello umano adulto sono stati effettuati come descritto in precedenza(Finkbeiner et al., 2015), e sono stati coltivati in una gocciolina di Matrigel utilizzando un mezzo condizionato L-WRN per stimolare la crescita epiteliale, come descritto in precedenza(Miyoshi et al., 2012; Miyoshi e Stappenbeck, 2013).

Coltura batterica

Escherichia coli ceppo ECOR2 (ATCC 35321) è stato coltivato in brodo di Luria (LB) media o piastre di agar LB 1,5% a 37 in condizioni di ossigeno atmosferico. Soluzioni a base di glicerolo sono disponibili su richiesta. Il genoma assemblato e annotato per l’isolato di Escherichia coli ceppo ECOR2 utilizzato in questi studi è disponibile suhttps://www.patricbrc.org/view/Genome/562.18521.E. coli ceppo K-12 MG1655 (CGSC #6300) è stato ottenuto dal Coli Genetic Stock Center presso l’Università di Yale(http://cgsc2.biology.yale.edu/) ed è stato utilizzato solo negli esperimenti di attività in vitro BD-2. L’intero sequenziamento del genoma del ceppo di E. coli ECOR2 è stato eseguito dal Laboratorio di Iniziativa Microbioma Host dell’Università del Michigan utilizzando la piattaforma Illumina MiSeq.

Microiniezione

Le microiniezioni sono state eseguite utilizzando un protocollo modificato da Leslie et al., 2015. In breve, gli HIO sono stati iniettati utilizzando capillari in vetro a parete sottile (TW100F-4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) modellati con un estrattore per micropipette P-30 (Sutter Instruments, Novato, CA). I microcapillari tirati sono stati montati su un supporto per micropipette Xenoworks con tubo analogico (BR-MH2 e BR-AT, Sutter Instruments) collegato a una siringa di vetro da 10 ml riempita con olio minerale sterile (Fisher Scientific, Hampton, NH). Il controllo fine della micropippetta è stato ottenuto utilizzando un micromanipolatore (Narishge International Inc., East Meadow, NY) e la microiniezione è stata completata con un ingrandimento 1-2X su un cannocchiale di dissezione stereo SX61 (Olympus, Tokyo, Giappone). Gli HIO sospesi a Matrigel (Corning Inc., Corning, NY) sono stati iniettati con circa 1 μl di soluzione. Un protocollo di microiniezione HIO dettagliato e aggiornato è disponibile su Hill, 2017b; una copia è archiviata suhttps://github.com/elifesciences-publications/HIO_microinjection). Negli esperimenti di microiniezione batterica, i terreni di coltura HIO sono stati rimossi immediatamente dopo la microiniezione e le colture sono state risciacquate con PBS e trattate con terreni ENR contenenti penicillina e streptomicina per rimuovere i batteri introdotti nei terreni di coltura durante il processo di microiniezione. Dopo 1 ora e 37 minuti, gli HIO sono stati nuovamente lavati in PBS e i terreni di coltura sono stati sostituiti con nuovi mezzi ENR privi di antibiotici.

Misurazione dell’ossigeno luminale

Il contenuto di ossigeno luminoso è stato misurato in HIOs utilizzando un microsensore impiantabile rivestito otticamente con una punta conica a <50 μm (IMP-PSt1, PreSens Precision Sensing GmbH) collegato ad un micro ossimetro a fibre ottiche (Microx TX3, PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germania). La sonda di ossigeno è stata calibrata secondo le istruzioni del produttore e le misurazioni dei supporti esterni e il contenuto di ossigeno HIO luminale sono stati raccolti montando il microsensore su un micromanipolatore (Narishge International Inc., East Meadow, NY) e guidando la punta del sensore in posizione usando l’ingrandimento 1-2X su un cannocchiale di dissezione stereo (Olympus, Tokyo, Giappone). Tutte le letture della concentrazione di ossigeno sono state analizzate usando il software PreSens Oxygen Calculator (TX3v531, PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germania). Per la misurazione dell’ipossia citoplasmatica relativa, le colture HIO sono state trattate con 100 μM di pimonidazolo HCl (Hypoxyprobe, Inc., Burlington, MA) aggiunto ai terreni di coltura esterni e incubate al 37% e 5% di CO2 per 2 ore prima della fissazione in parafomaldeide al 4%. I coniugati di pimonidazolo sono stati colorati in sezioni di tessuto utilizzando l’anticorpo monoclonale IgG Ipoxyprobe-1 di topo (Hypoxyprobe, Inc., Burlington, MA, RRID:AB_2335667) con anticorpo secondario appropriato (vedi tabella delle diluizioni anticorpali).

Immunoistochimica

L’immunocolorazione è stata effettuata come descritto in precedenza(Finkbeiner et al., 2015). Informazioni sugli anticorpi e sulle diluizioni si trovano nel file supplementare 2. Tutte le immagini sono state scattate con un microscopio confocale Nikon A1 o con un microscopio epifluorescente Olympus IX71. 3. Il tampone di blocco CarboFree (SP-5040; Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) è stato sostituito con il siero d’asino diluito in PBS nella colorazione per le mucine e i moieties dei carboidrati. Trattamento EdU e l’etichettatura fluorescente EdU utilizzando la chimica Click-iT è stato applicato secondo le istruzioni del produttore (# C10339 Thermo Fisher, Waltham, MA). Il file supplementare 2 contiene una tabella di tutti gli anticorpi primari e secondari, le condizioni di blocco e le informazioni per ordinare il prodotto.

Inibizione NF-κB

L’inibitore NF-κB SC-514 (Kishoreet al., 2003; Litvak et al., 2009) (Tocris Cookson, Bristol, UK) è stato risospeso in DMSO ad una concentrazione di 25 mM. Gli HIO sono stati trattati con SC-514 in sospensione in DMSO aggiunto ai mezzi di coltura esterni ENR ad una concentrazione finale di 1 μM. L’efficacia di SC-514 è stata verificata da Western blot di lisati da HIO iniettati con PBS o E. coli vivo o iniettati con E. coli vivo in presenza di 1 μM SC-514 aggiunto ai mezzi esterni. Gli IO sono stati raccolti dopo 24 ore in tampone di lisi composto da 300 mM NaCl, 50 mM Tris base, 1 mM EDTA, 10% glicerolo, 0,5% NP-40, e 1X Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). I lisati sono stati separati su un gel di poliacrilamide Bis-Tris al 10% in condizioni riducenti (Invitrogen, Carlsbad, CA) e trasferiti al PVDF utilizzando un apparato di trasferimento a umido (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) durante la notte alle 4. La membrana del PVDF è stata bloccata nel buffer di blocco Odyssey TBS (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). La membrana è stata immersa in tampone di blocco contenente anticorpi monoclonali primari di coniglio contro NF-κB p65 fosforilato (1:200, Cell Signaling Technology #3033S) o totale NF-κB p65 (1:400, Cell Signaling Technology #8242S) e incubata a temperatura ambiente per 2 ore. Tutti i lavaggi sono stati condotti in soluzione salina tamponata con Tris con 1% Tween-20 (TBST). La capra secondaria anti-coniglio IgG IRDye IgG 800CW è stato diluito 1:15.000 in TBST ed esposto alla membrana lavata per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo ulteriori lavaggi, la membrana in PVDF è stata ripresa con un Odyssey Scanner (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).

Saggio di traslocazione batterica

L’incidenza della traslocazione batterica è stata determinata in HIO placcati singolarmente in singoli pozzetti di piastre a 24 pozzetti e microiniettati con E. coli. I terreni di coltura esterni sono stati raccolti e sostituiti quotidianamente. I terreni di coltura raccolti sono stati diluiti 1:10 in brodo LB in 96 piastre a 96 pozzetti e sono stati messi in coltura a 37 durante la notte. La densità ottica (600 nm) è stata misurata nelle colture di brodo LB a 96 pozzetti utilizzando un lettore di micropiastre VersaMax (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA). OD600> sterile brodo di brodo LB linea di base è stata considerata una coltura positiva.

Permeabilità FITC-dextran

Per i saggi di permeabilità epiteliale, gli HIO sono stati microiniettati con 4 kDa FITC-dextran in sospensione in PBS ad una concentrazione di 2 mg/ml come descritto in precedenza(Leslie et al., 2015) utilizzando il sistema di microiniezione descritto in precedenza. Le immagini sono state raccolte a intervalli di 10 minuti a 4X ingrandimento su un microscopio epifluorescente Olympus IX71 utilizzando un sistema di imaging a cellule vive Deltavision RT con il software di imaging Applied Precision softWoRx (GE Healthcare Bio-Sciences, Marlborough, MA). Le colture sono state mantenute al 37% e 5% di_CO2 in tutto il corso del tempo di imaging. Per gli esperimenti che coinvolgono il trattamento delle citochine, ricombinante TNF-α (#210-TA-010, R e D Systems) e INF-γ (#AF-300-02, Peprotech) sono stati aggiunti ai mezzi di coltura esterna ad una concentrazione di 500 ng / ml all’inizio dell’esperimento. Un dettagliato e aggiornato protocollo di microiniezione HIO e di imaging dal vivo è disponibile su(Hill, 2017b).

Saggio di attività antimicrobica in vitro

BD-2 umano ricombinante (Abcam, Cambridge, MA) è stato ricostituito in brodo LB sterile e diluito a 0,1-1 μg/ml. Le colture di E. coli sono state diluite 1:1000 in LB sterile contenente 0-1 μg/ml di BD-2 e trasferite in una micropiastra a 96 pozzetti. Un lettore di micropiastre VersaMax (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA) è stato utilizzato per misurare OD600 a intervalli di 10 minuti in micropiastre mantenute a 37°C con scuotimento regolare su un arco di tempo di 18 ore. Per i saggi antimicrobici in fase stazionaria, colture notturne di E. coli str. ECOR2 sono state diluite in PBS contenente 1 μg / ml BD-2 o BD-2 inattivato a caldo (riscaldato a 120 per > 60 min) e posto in un incubatore batterico 37 per 5 ore. Le colture sono state poi diffuse su piastre di agar LB e coltivate durante la notte. Il numero di CFU è stato contato manualmente.

Saggi ELISA

Le concentrazioni di citochina secreta, peptide antimicrobico e fattore di crescita sono state determinate mediante ELISA (Duosets, R e D Systems, Minneapolis, MN) utilizzando le procedure raccomandate dal produttore presso il Centro di monitoraggio immunologico dell’Università del Michigan Cancer Center.

Sequenziamento e analisi dell’RNA

L’RNA è stato isolato utilizzando il kit di isolamento dell’RNA mirVana e seguendo il protocollo di isolamento ‘RNA totale’ (Thermo-Fisher Scientific, Waltham MA). RNA preparazione biblioteca RNA e RNA-sequenziamento (single-end, 50 bp lunghezza di lettura) sono state eseguite dalla University of Michigan DNA Sequenziamento Core utilizzando la Illumina Hi-Seq 2500 piattaforma. Tutte le sequenze sono state depositate nel database EMBL-EBI ArrayExpress (RRID:SCR_004473) utilizzando Annotare 2.0 e sono catalogate con il numero di adesione E-MTAB-5801. L’analisi quantitativa delle trascrizioni è stata condotta utilizzando la versione stabile a 64 bit di Debian Linux Linux 7.10 (‘Wheezy’). Lo pseudoallineamento dei dati RNA-seq è stato calcolato usando kallisto v0.43.0(Bray et al., 2016) e l’espressione differenziale delle sequenze pseudoallineate è stata calcolata usando il pacchetto R DEseq2(Love et al., 2014) (RRID:SCR_000154).

Analisi statistica

Se non diversamente indicato nelle leggende delle figure, le differenze tra i gruppi sperimentali o le condizioni sono state valutate utilizzando il t-test di uno studente non accoppiato. Un p-valore <0,05 è stato considerato rappresentare un risultato statisticamente significativo. Tutte le analisi statistiche sono state condotte utilizzando la versione R 3.4.1 (2017-06-30)(Core Team, 2017) e i grafici sono stati generati utilizzando il pacchetto R ggplot2(Wickham, 2009) con il pacchetto di espansione ggstance(Henry et al., 2016). Il test multiplo FDR regolato per il test è stato calcolato utilizzando l’implementazione DESeq2 del test di Wald(Love et al., 2014). I test di sovrarappresentazione del percorso genico e l’analisi dell’arricchimento del set di geni(Subramanian et al., 2005) sono stati implementati utilizzando i pacchetti R clusterProfiler(Yu et al., 2012) e ReactomePA(Yu and He, 2016). Le analisi condotte in R sono state raccolte utilizzando Emacs v25.2(Stallman, 1981) con Org-mode v8.3.5 e la carta è stata scritta in LaTeX utilizzando Emacs. Gli script di analisi completi sono disponibili nel repository Hill, 2017a GitHub (copia archiviata all’indirizzohttps://github.com/elifesciences-publications/Hill_HIO_Colonization_2017).

References

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Fonte

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