Identificazione sistematica delle mutazioni e delle alterazioni del numero di copie associate alla prognosi dei pazienti affetti da cancro

Introduzione

I tumori che nascono dallo stesso tessuto possono presentare grandi differenze nel comportamento clinico. Ad esempio, tra gli individui a cui è stato diagnosticato un cancro colorettale in stadio precoce, circa il 60% dei pazienti sarà curato con la sola chirurgia, mentre il restante 40% sperimenterà una recidiva che è spesso fatale(Mäkelä et al., 1995). Diversi biomarcatori patologici e molecolari sono tipicamente analizzati per valutare il rischio del paziente e aiutare il processo decisionale clinico. In generale, questi biomarcatori sono suddivisi in due classi: predittivi e prognostici(Nalejska et al., 2014). I biomarcatori predittivi identificano i pazienti che probabilmente rispondono a terapie specifiche, come le mutazioni dell ‘EGFR che sensibilizzano i tumori polmonari all’inibizione dell’EGFR(Paez et al., 2004). Al contrario, i biomarcatori prognostici forniscono informazioni sull’aggressività del cancro e sulla probabilità di morte del paziente. La de-differenziazione del tumore e l’infiltrazione dei linfonodi servono come biomarcatori prognostici prototipici a causa della loro forte associazione con gli esiti negativi(Connolly et al., 2003). Tuttavia, questi biomarcatori basati sulla patologia possono soffrire di bassi livelli di concordanza tra gli osservatori(Allsbrook et al., 2001; Coons et al., 1997; Elmore et al., 2015; Gilks et al., 2013), e anche una valutazione patologica perfetta fornisce informazioni incomplete sul decorso clinico più probabile di un paziente (Bijker et al.,2013; Nofech-Mozes et al. , 2005; Young, 2003; Zaniboni et al., 2004). Nuovi metodi per identificare i tumori aggressivi potrebbero portare a miglioramenti nella stratificazione del rischio del paziente, a una migliore gestione clinica e a una diminuzione di trattamenti eccessivi pericolosi e non necessari(Esserman et al., 2013).

I progressi nelle tecnologie ad alto rendimento hanno dato una visione senza precedenti della vasta gamma di cambiamenti genomici che si trovano all’interno di ogni cellula tumorale. Progetti come The Cancer Genome Atlas (TCGA) e l’International Cancer Genome Genome Consortium (ICGC) hanno caratterizzato la metilazione, la mutazione, il numero di copie e i modelli di espressione genica in tutti i tipi di cancro. Come risultato di questi studi, molte delle differenze genomiche tra cellule normali e trasformate sono state identificate e caratterizzate. Tuttavia, ci manca una comprensione simile delle differenze genomiche tra tumori indolenti e tumori maligni aggressivi. Poiché il costo del sequenziamento del DNA continua a diminuire, è diventato sempre più fattibile per gli ospedali implementare analisi di routine mirate e/o analisi genomiche dei tumori dei pazienti(Gagan e Van Allen, 2015; Sholl et al., 2016; Zehir et al., 2017). Ma, mentre sono stati scoperti diversi biomarcatori predittivi basati sul DNA e specifici per la terapia, le informazioni prognostiche contenute nei genomi dei tumori sono molto meno chiare.

I precedenti sforzi a livello genomico per scoprire nuovi biomarcatori prognostici si sono concentrati in gran parte sui cambiamenti di espressione genica associati alla mortalità dei pazienti(Anaya, 2016; Anaya et al., 2015; Gentles et al., 2015; Uhlen et al., 2017). Questi studi hanno identificato una serie di trascrizioni che codificano le proteine coinvolte nella progressione del ciclo cellulare che sono correlate con la ricorrenza e la morte in diversi tipi di cancro(Cuzick et al., 2011; Dancik e Theodorescu, 2015; Gentles et al., 2015; Mosley e Keri, 2008; Venet et al., 2011; Wang et al., 2012; Wistuba et al., 2013). Si sa relativamente meno di quanto i cambiamenti a livello di DNA influiscano sulla sopravvivenza dei pazienti. Le analisi delle mutazioni genetiche associate ai risultati sono state condotte prevalentemente su un numero limitato di oncogeni noti di singoli tipi di cancro e sono giunte a conclusioni divergenti. I rapporti della letteratura suggeriscono comunemente che le mutazioni negli oncogeni pilota sono associate a scarsi risultati, tra cui, ad esempio, le mutazioni KRAS nel cancro del polmone(Guan et al., 2013; Marabese et al., 2015; Sun et al., 2013), le mutazioni PIK3CA nel cancro al seno(Li et al., 2006; Oshiro et al., 2015) e le mutazioni BRAF nel cancro del colon-retto(Richman et al., 2009; Roth et al., 2010; Tol et al., 2009). Altri studi degli stessi geni negli stessi tipi di cancro non hanno osservato alcuna associazione significativa con l’esito(Bozhanov et al., 2010; Gonzalez-Angulo et al., 2009; Hutchins et al., 2011; Pang et al., 2014; Scoccianti et al., 2012). In generale, gli studi sui biomarcatori basati sulle mutazioni possono essere confusi da piccole dimensioni dei campioni, da test di ipotesi post-hoc, da endpoint clinici imprecisi e dal cosiddetto problema del “cassetto delle cartelle”, in cui è meno probabile che vengano pubblicati risultati negativi (Aronson,2005; Ensor, 2014; Goossens et al., 2015; Rosenthal, 1979; Scargle, 1999). Le informazioni prognostiche catturate dal sequenziamento degli oncogeni pilota rimangono sconosciute, e non è stata condotta un’analisi pan-cancro a livello di exomero delle mutazioni associate ai risultati.

Precedenti indagini sull’importanza prognostica delle alterazioni del numero di copie di DNA (CNA) hanno indicato che i tumori altamente anuploidi tendono ad avere esiti peggiori dei tumori diploidi(Friedlander et al., 1984; Kallioniemi et al., 1987; Kokal et al., 1986; Merkel e McGuire, 1990; Zimmerman et al., 1987). Tuttavia, queste analisi si sono concentrate in gran parte sui cambiamenti di lunghezza del braccio(Davoli et al., 2017; Roy et al., 2016) o sulle alterazioni che riguardano singoli oncogeni o soppressori tumorali(Deming et al., 2000; Shi et al., 2012; Srividya et al., 2011). L’importanza funzionale delle alterazioni del numero di copie nella maggior parte dei geni a livello di singolo gene è sconosciuta, e non è stata condotta un’analisi pan-cancro, gene per gene, delle alterazioni prognostiche del numero di copie. Al fine di ottenere una comprensione globale delle caratteristiche genomiche di un tumore primitivo che influenzano la prognosi del cancro, abbiamo raccolto e analizzato i profili molecolari da una serie di ‘scoperta’ di 9442 pazienti e da una serie di ‘validazione’ di 8618 pazienti con tumori solidi. La nostra analisi completa e centrata sui geni fa luce sui cambiamenti genomici che guidano la malattia aggressiva e fornirà una risorsa utile per lo sviluppo di strategie per migliorare la valutazione del rischio clinico. Inoltre, mettiamo a disposizione un portale web per facilitare l’accesso della comunità a questo ricco set di dati sui biomarcatori all’indirizzo http://survival.cshl.edu.

Un’analisi multipiattaforma e pan-cancro dei dati sulla sopravvivenza al cancro

Per determinare le differenze tra tumori benigni e tumori mortali, abbiamo prima analizzato più classi di dati genomici di 9442 pazienti con 16 tipi di tumore del TCGA (descritti nella Figura 1-figure supplement 1A; le abbreviazioni sono definite nella Figura 1-figure supplement 1B). Per ogni tipo di tumore e per ogni set di dati, abbiamo generato modelli di rischio proporzionali univariata Cox che collegano la presenza o l’espressione di una particolare caratteristica con l’esito clinico (descritto nel testo integrativo 1). Per ogni modello riportiamo il punteggio Z, che codifica sia la direzionalità che il significato di una particolare associazione. Se la presenza di una mutazione o di un’amplificazione del numero di copie è associata in modo significativo alla morte del paziente, allora un punteggio Z >1,96 corrisponde a un valore P < 0,05 (Figura 1-figuresupplement 2A-C). Al contrario, un punteggio Z inferiore a -1,96 indica che la presenza di una mutazione è associata alla sopravvivenza o che la delezione di un gene è significativamente associata alla morte del paziente.

Abbiamo estratto la mutazione, il numero di copie, l’espressione genica e le informazioni cliniche da 16 coorti TCGA (riassunti nel file supplementare 1 e discussi in dettaglio nel testo supplementare 2). Per valutare la validità della nostra pipeline di analisi dei dati, così come l’accuratezza delle annotazioni dei pazienti segnalati, abbiamo prima esaminato le curve di sopravvivenza complessive per i 16 tipi di tumore che abbiamo profilato. Come previsto, abbiamo osservato differenze significative nell’esito clinico in base al tessuto di origine del tumore (Figura 1-figure supplement 2D). Il tumore della prostata ha avuto il decorso clinico meno aggressivo, con un tempo di sopravvivenza mediano che non è stato raggiunto in questo dataset (>4600 giorni), mentre il tumore del pancreas ha conferito la prognosi peggiore (tempo di sopravvivenza mediano: 444 giorni). Complessivamente, le frequenze di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti nel TCGA sono state molto simili alle medie nazionali riportate da NCI-SEER (R = 0,83, p < 0,0001), suggerendo che i pazienti inclusi in questa analisi sono ampiamente rappresentativi della popolazione generale (Figura 1-figuresupplement 2E). Successivamente, abbiamo dedotto il sesso del paziente sulla base di modelli di espressione genica cromosomica specifica(Gentles et al., 2015; van den Berge e Sijen, 2017). La nostra analisi ha mostrato una concordanza >99% con il sesso dichiarato del paziente, verificando ulteriormente l’accuratezza complessiva delle annotazioni cliniche e la nostra pipeline di elaborazione dei dati (Figura 1-figuresupplement 2F).

Le mutazioni tumorali trasmettono informazioni prognostiche limitate

Per prima cosa abbiamo cercato di scoprire se le mutazioni di codifica dei genomi tumorali erano associate all’esito del paziente. Abbiamo estratto le mutazioni non silenti in ogni tumore, e poi abbiamo identificato tutti i geni che sono stati mutati in ≥2% dei pazienti in ciascuna delle 16 coorti (discusso nel testo supplementare 1). Abbiamo poi eseguito l’analisi dei pericoli proporzionali di Cox per confrontare i tempi di sopravvivenza dei pazienti che ospitano copie mutanti o di tipo selvaggio di ciascun gene. Questa analisi ha scoperto pochissime mutazioni che sono state associate in modo significativo al risultato del paziente(figura 1 e file supplementare 2A-B). Ci siamo concentrati in primo luogo sugli oncogeni e sui soppressori tumorali conosciuti e abbiamo scoperto che tra i 30 geni guida del cancro più frequentemente mutati, solo due(EGFR e TP53) sono stati associati alla prognosi in più di due tipi di tumore(Figura 1C). Le mutazioni del TP53 erano legate all’esito in cinque dei 16 tipi di tumore, anche se le differenze nella sopravvivenza dei pazienti erano generalmente piccole(Figura 1-figure supplement 3A-B). Al contrario, molti altri geni guida del cancro non erano associati al tempo di sopravvivenza in nessun tipo di tumore. Mentre mutazioni in KRAS, PIK3CA, CDKN2A, BRAF, KMT2D, ATM, SMAD4, e molti altri geni sono stati osservati frequentemente, non sono mai stati significativamente legati all’esito del paziente(Figura 1C).

Abbiamo poi considerato la possibilità che le mutazioni in specifici codoni possano avere un significato prognostico non catturato quando tutte le mutazioni in un gene sono messe insieme. Per testare questo, abbiamo identificato le 30 posizioni amminoacidiche più frequentemente mutate nelle coorti TCGA, e poi abbiamo chiesto se i pazienti che ospitano queste mutazioni hanno avuto esiti diversi rispetto a quelli che non le hanno avute. IDH1c132 mutazioni sono stati significativamente associati con una prognosi favorevole nel glioma, ma altri codoni ricorrenti-mutate (KRASc12, PIK3CAc1047, TP53c273, ecc) sono stati in gran parte disinformativi(Figura 1-figure supplemento 4A-D). Poi, abbiamo identificato i residui ‘hotspot’ che sono stati mutati in almeno cinque diversi pazienti in tutte le coorti. Considerando solo queste mutazioni ‘hotspot’ in ogni gene, anche queste mutazioni ‘hotspot’ non sono riuscite a scoprire robuste associazioni di sopravvivenza (Figura 1-figuresupplement 4E). Infine, abbiamo identificato mutazioni ricorrenti specifiche per il tipo di cancro, ma queste alterazioni (FGFR3c249 in BLCA, CTNNB1c37 in UCEC, ecc.) erano altrettanto disinformative(Figura 1-figure supplement 4F).

Successivamente, abbiamo cercato di verificare se l’uso di terapie mirate avesse attenuato gli effetti deleteri di alcune mutazioni dei driver (ad esempio, in BRAF o EGFR). Tuttavia, a causa dei tempi di raccolta dei campioni, pochissimi pazienti sono stati trattati con inibitori del BRAF o dell’EGFR, e la rimozione di quei pazienti che avevano ricevuto queste terapie non ha influito in modo significativo sui punteggi Z(Figura 1-figure supplement 5A). L’ipermutazione all’interno di un sottoinsieme di tumori potrebbe aumentare il “rumore” mutazionale e diminuire la nostra capacità di identificare le firme prognostiche, ma l’esclusione dei pazienti con tumori iper-mutati ha avuto un effetto minimo sul significato prognostico delle mutazioni del gene guida (Figura 1-figuresupplement 5B e Supplementary file 2C). Ci siamo quindi chiesti se la presenza di mutazioni nei geni driver di tumori multipli potesse cooperare per conferire un esito clinico peggiore. Abbiamo scoperto che, in generale, i pazienti che ospitano mutazioni in due geni pilota del cancro che non sono prognostici da soli avevano lo stesso rischio di morte dei pazienti con copie di uno o entrambi i geni(Figura 1-figure supplement 5C). Infine, abbiamo considerato la possibilità che la clonalità di una mutazione potesse influenzare il suo significato prognostico. Abbiamo calcolato la frequenza dell’allele variante (VAF) per ogni mutazione tumorale e abbiamo testato se le mutazioni presenti a livello clonale in singoli tumori erano più probabilmente associate all’esito. Abbiamo scoperto che limitando la nostra analisi alle mutazioni con VAF elevati non siamo riusciti a identificare più geni prognostici, indicando che la stratificazione del paziente è improbabile che venga migliorata valutando solo le mutazioni clonali(Figura 1-figure supplement 6).

Queste analisi hanno suggerito che, in generale, le mutazioni del gene guida del cancro mancano di un significativo potere di stratificazione del paziente. Questo ci ha portato ad indagare se le mutazioni in geni diversi dagli oncogeni a mutazioni ricorrenti e dai soppressori tumorali potessero influenzare la prognosi. Abbiamo quindi ampliato la nostra analisi per includere tutti i geni mutati in ≥2% dei pazienti con un particolare tipo di tumore. Per tenere conto di una notevole espansione del numero di geni testati, abbiamo applicato una correzione di Benjamini-Hochberg con un tasso di falsificazione del 5% ai punteggi individuali Z che abbiamo ottenuto. Abbiamo scoperto diversi geni che erano legati alla prognosi nel glioma, ma abbiamo trovato pochissimi geni significativamente associati alla morte o alla sopravvivenza negli altri 15 tipi di tumore(Figura 1D e file supplementare 2A). Ad esempio, nel carcinoma mammario e nell’adenocarcinoma polmonare, 128 e 3996 geni sono stati mutati rispettivamente in ≥2% delle pazienti, ma nessuna di queste mutazioni è stata correlata in modo significativo con l’esito del paziente ad un FDR del 5%. In totale, questi risultati indicano che la maggior parte delle mutazioni nei genomi tumorali manca di un significativo potere prognostico.

Mutazioni prognostiche sottotipo-indipendenti e sottotipo-indipendenti nei gliomi

Nella nostra analisi di cui sopra, abbiamo notato che i cinque geni con le associazioni di sopravvivenza più forti sono stati tutti osservati nella coorte GBMLGG (pan-glioma). Poiché il glioma sembrava essere un’eccezione alla nostra constatazione generale che le mutazioni sono raramente prognostiche, abbiamo indagato ulteriormente questa coorte. Tra i geni con il punteggio più alto, abbiamo trovato che le mutazioni di PTEN ed EGFR conferiscono una prognosi sfavorevole, mentre le mutazioni in IDH1, TP53 e ATRX sono associate a una prognosi favorevole(Figura 1-figure supplement 7A). Le mutazioni in questi geni sono state precedentemente collegate a sottotipi di gliomi distinti(Ceccarelli et al., 2016; Kannan et al., 2012; Suzuki et al., 2015), e abbiamo verificato che le mutazioni in IDH1, TP53, e ATRX sono state osservate più frequentemente nei glioblastomi di basso grado, mentre le mutazioni in PTEN e EGFR sono state osservate più frequentemente nei glioblastomi di alto grado(Figura 1-figure supplement 7B). Tuttavia, quando abbiamo analizzato separatamente i glioblastomi e i glioblastomi di basso grado, molte di queste alterazioni sono rimaste prognostiche(file supplementare 2D). Per esempio, mentre le mutazioni dell’IDH1 erano più comuni nei gliomi a basso grado, sono state occasionalmente osservate anche nei tumori di alto grado, e sono state associate indipendentemente alla sopravvivenza prolungata in entrambe le coorti(Figura 1-figure supplement 7C). Al contrario, quando le mutazioni EGFR sono state osservate nei glioblastomi di basso grado, sono state associate a scarsi risultati, ma le mutazioni EGFR non erano prognostiche nei glioblastomi di alto grado(Figura 1-figure supplement 7D). Quindi, nei glioblastomi, le mutazioni contengono sia informazioni prognostiche sottotipo-dipendenti che sottotipo-indipendenti. Tuttavia, al di fuori di questo tipo di cancro e del soppressore tumorale TP53, le mutazioni nella maggior parte dei geni guida del cancro non sono prognostiche.

I CNA dei geni guida sono comunemente associati alla mortalità dei pazienti affetti da cancro

Poiché le mutazioni erano in gran parte disinformative, ci siamo poi impegnati a determinare se il numero di copie geniche trasmetteva informazioni prognostiche. Abbiamo determinato il numero di copie di ogni gene nel suo sito di inizio trascrizionale e abbiamo regredito questo valore rispetto all’esito del paziente in ogni coorte tumorale. Abbiamo poi esaminato l’impatto clinico dei CNA che interessano gli stessi 30 geni guida del cancro che abbiamo studiato in precedenza. Sorprendentemente, abbiamo scoperto che il numero di copie di questi oncogeni e soppressori tumorali era spesso collegato all’esito del paziente(Figura 2 e file supplementare 3A-B). L’amplificazione di EGFR, PIK3CA e BRAF e la cancellazione di CDKN2A, RB1 ed EP300 erano fortemente associati a tempi di sopravvivenza del paziente più brevi in quattro o più tipi di cancro ciascuno. Il numero di copie era prognostico anche per i geni in cui le mutazioni non erano legate all’esito: ad esempio, mentre le mutazioni nel PIK3CA non erano mai informative, il numero di copie del PIK3CA era associato all’esito nei tumori della mammella, del colorettale, del glioma, del polmone squamoso, del pancreas e della prostata(Figura 2B e D). Nel complesso, tra i 30 geni guida del cancro più frequentemente mutilati, abbiamo rilevato 108 associazioni significative tra numero di copie geniche ed esito, rispetto alle 23 associazioni tra mutazione ed esito. Per 28 dei 30 geni guida, il numero di copie di DNA era prognostico in più tipi di cancro rispetto allo stato di mutazione. Concludiamo che determinare il numero di copie di oncogeni e soppressori tumorali in un tumore primitivo può stratificare meglio il rischio del paziente rispetto alla valutazione delle mutazioni di una singola coppia di basi.

Nella nostra analisi finora, abbiamo trattato le mutazioni come variabile binaria (“mutante” vs. “non mutante”), mentre le alterazioni del numero di copie sono trattate come valori continui. Così, il maggiore significato prognostico dei CNA tumorali potrebbe riflettere il fatto che le misurazioni dei singoli CNA contengono intrinsecamente più informazioni. Per testare questa possibilità, abbiamo trifotomizzato i valori del CNA in ‘delezioni’ (<-0.3), ‘amplificazioni’ (>0.3), e ‘copia-neutro’ (≥-0.3 e≤0.3). Abbiamo quindi calcolato le regressioni Cox agli stessi 30 loci utilizzando i valori discreti del numero di copie. Questa analisi ha portato a 94 associazioni di sopravvivenza significative, più di quattro volte il numero di caratteristiche significative come quando le mutazioni sono state analizzate, e paragonabile al numero di caratteristiche significative che sono risultate utilizzando i valori continui del CNA(Figura 2-figure supplement 1). Questa analisi suggerisce che la maggiore significatività prognostica dei CNA non è semplicemente una conseguenza della natura continua dei dati del numero di copie.

Abbiamo poi indagato se questi CNA oncogeni e soppressori tumorali erano suscettibili di guidare la mortalità dei pazienti, o se erano geni passeggeri che cambiavano nel numero di copie insieme ad altri driver sconosciuti. Per valutare questa domanda, abbiamo combinato i punteggi Z di diversi tipi di cancro utilizzando il metodo di Stouffer (Stouffer, 1949), e poi abbiamo tracciato i punteggi meta-Z del pan-cancro lungo ogni cromosoma (Figura 2C). Questa analisi ha rivelato molteplici picchi e valli taglienti nei dati che si sono sovrapposti a mutazioni note dei driver. Le più significative variazioni del numero di copie di sopravvivenza associate alla sopravvivenza, a livello genomico, sono state trovate sul cromosoma 9p in una valle che includeva precisamente il soppressore tumorale CDKN2A. I picchi di punteggio Z sono stati trovati in loci che includono oncogeni PIK3CA, EGFR, MYC, CCNE1, e altri. Questa sovrapposizione suggerisce che, in molti casi, il numero di copie di questi oncogeni e soppressori tumorali influenza direttamente il rischio di morte dei pazienti affetti da cancro.

Il significato prognostico dei CNA è indipendente dalla purezza del campione tumorale e dall’infiltrazione immunitaria

L’aneuploidia del cromosoma intero è stata precedentemente collegata ad una diminuzione dell’infiltrazione delle cellule immunitarie(Davoli et al., 2017; Taylor et al., 2018). Abbiamo quindi considerato la possibilità che i CNA siano prognostici attraverso un meccanismo indiretto, cioè che si trovano nei tumori che mancano di una robusta infiltrazione immunitaria, e questa risposta immunitaria carente era di per sé la causa della mortalità dei pazienti. Tuttavia, molteplici linee di prova sostengono contro questa interpretazione. In primo luogo, abbiamo valutato l’associazione tra la sopravvivenza del paziente e tre diverse misure della purezza del campione tumorale: la frazione cellulare tumorale valutata dal patologo, la purezza del campione come giudicata da ABSOLUTE(Carter et al., 2012; Taylor et al., 2018), e l’infiltrazione dei leucociti, come giudicata dall’analisi della metilazione(Taylor et al., 2018). Abbiamo scoperto che la purezza del campione era associata in modo incoerente con l’esito del paziente(Figura 2-figure supplement 2). Ad esempio, una maggiore purezza del tumore determinata dall’analisi patologica o ASSOLUTA è stata associata ad un risultato peggiore in una sola delle 16 coorti, ciascuna(Figura 2-figure supplement 2A-B). La mancanza di una forte correlazione tra popolazioni cellulari infiltrate e prognosi clinica suggerisce che la purezza dell’analita è insufficiente a spiegare la relazione tra CNA e sopravvivenza del paziente. In secondo luogo, abbiamo generato modelli Cox multivariati che includevano il numero di copie geniche e queste tre misurazioni della purezza del tumore, e abbiamo trovato che i CNA dei geni guida rimangono ampiamente prognostici in questi modelli bivariati(Figura 2-figure supplement 2C e Supplementary file 3C-E). Per esempio, abbiamo scoperto che l’amplificazione del Ciclino E1 è associata ad una prognosi sfavorevole nel cancro ovarico, e questo è rimasto vero anche quando la nostra analisi è stata limitata a campioni di tumore ad alta purezza e a campioni che mancavano di una significativa presenza di leucociti(Figura 2-figure supplement 2D). Quindi, mentre l’interrelazione tra aneuploidia e tolleranza immunologica gioca probabilmente un ruolo importante nello sviluppo del tumore, questa analisi suggerisce che non è il driver primario della mortalità della paziente associata al CNA.

L’analisi del numero di copie migliora la stratificazione del paziente conferita dai parametri clinici comuni

La valutazione patologica dello stadio e del grado del tumore è una fonte importante di informazioni prognostiche, anche se le valutazioni in cieco rivelano una significativa discordanza tra gli osservatori(Allsbrook et al., 2001; Coons et al., 1997; Elmore et al., 2015; Gilks et al., 2013). Abbiamo quindi testato se i biomarcatori CNA che abbiamo scoperto potrebbero influenzare la stratificazione conferita da questi parametri. Abbiamo trovato che i punteggi Z generati da modelli univariati o multivariati che includevano lo stadio o il grado erano altamente correlati (R = 0,91 e R = 0,96 rispettivamente; Figura 2-figure supplement 3A e Supplementary file 4). Nel complesso, il 71% dei CNA prognostici nei singoli tipi di cancro è rimasto prognostico in questi modelli multivariati(Figura 2-figure supplement 3B). Quindi, includere la valutazione del numero di copie a livello genico può migliorare significativamente la stratificazione del rischio del paziente oltre i parametri clinici standard(Figura 2-figure supplement 3C-D). Alcune mutazioni sono state analogamente in grado di fornire informazioni prognostiche in modo indipendente dallo stadio e dal grado. Tuttavia, a causa della minore significatività complessiva della maggior parte delle mutazioni che abbiamo identificato, i miglioramenti nella stratificazione dei pazienti sono stati generalmente più modesti(Figura 2-figure supplement 3E e Supplementary file 4E).

Anche i valori del numero di copie a livello genico sono rimasti prognostici quando si è proceduto alla separazione delle coorti TCGA per sottotipo di cancro(Figura 2-figure supplement 4 e Supplementary file 4F-G). Per esempio, i valori dei punteggi CNA Z erano altamente correlati tra la coorte GBMLGG di massa e i singoli sottotipi GBM e LGG (R = 0,68 e R = 0,86, rispettivamente; Figura 2-figure supplement 4A). Mentre si analizzava la coorte GBM separatamente abolito il significato prognostico delle mutazioni EGFR(Figura 2-figure supplement 4D), amplificazioni EGFR è rimasto associato con il risultato in entrambe le coorti LGG e GBM (Figura 2-figure supplement 4B-C). Le amplificazioni in MYC e PIK3CA sono state prognostiche in modo simile in più sottotipi tumorali(Figura 2-figure supplement 4D-E e Supplementary file 4G). In altri loci, il basso numero di pazienti di alcuni sottotipi può oscurare il rilevamento di biomarcatori specifici. Ad esempio, all’interno della coorte KIPAN, il 67% dei tumori sono carcinomi a cellule chiare, il 23% dei tumori sono carcinomi a cellule papillari e il 10% dei tumori sono carcinomi cromofobici. La delezione di CDKN2A è un forte indicatore di una prognosi sfavorevole nella coorte dei reni, nei carcinomi a cellule chiare e nei carcinomi a cellule papillari, ma non ha raggiunto una significatività statistica quando i carcinomi cromofobici renali sono stati analizzati in modo indipendente(Figura 2-figure supplement 4F-G). In totale, questi risultati sottolineano la capacità dei CNA del gene guida di migliorare la stratificazione del paziente quando si controlla l’identità del tumore, anche se un numero maggiore di coorti può essere necessario per identificare i biomarcatori più forti nei sottotipi di cancro rari.

I CNA del gene pilota contengono informazioni prognostiche non catturate dallo stato di mutazione del TP53 o dall’aneuploidia totale

I tumori altamente aneuploidi tendono ad ospitare mutazioni nella TP53, e sia le mutazioni della TP53 che l’aneuploidia al braccio sono state precedentemente associate a scarsi risultati clinici(Davoli et al., 2017; Petitjean et al., 2007). Utilizzando un ‘punteggio di aneuploidia’ per ciascun tumore basato sul numero totale di alterazioni di lunghezza del braccio (Tayloret al., 2018), abbiamo verificato che i tumori TP53-mutanti presentano più aneuploidia rispetto ai tumori di tipo TP53-paura (Figura 3-figuresupplement 1A), e che l’aneuploidia totale è un fattore di prognosi sfavorevole in diversi tipi di cancro (Figura 3-figuresupplement 1C). Per indagare la relazione tra i CNA prognostici a livello genico, lo stato del TP53 e l’aneuploidia del braccio, abbiamo selezionato una serie di 40 amplificazioni prognostiche e delezioni per ulteriori analisi(Figura 3-figure supplement 2A). Nei modelli multivariati che includevano lo stato di mutazione del TP53, 33 di 40 (83%) CNA a livello genico sono rimasti prognostici, dimostrando che questi CNA non sono legati alla morte a causa di un’associazione indiretta con lo stato del TP53(Figura 3-figure supplement 2A-B). Allo stesso modo, nei modelli multivariati che includevano l’aneuploidia tumorale totale, l’80% di questi CNA erano ancora associati all’esito(Figura 3-figure supplement 2C-D). Infine, come proxy del carico di alterazione strutturale totale, abbiamo sommato il numero di breakpoint (come indicato dai valori del numero di copie discrete lungo un cromosoma) in ogni tumore(Figura 3-figure supplement 1B). Questa metrica è stata associata all’esito in più tipi di tumore(Figura 3-figure supplement 1C), ma il 75% dei CNA del gene pilota è rimasto prognostico in modelli multivariati che includevano questo punteggio (Figura 3-figure supplement 2E-F). Questi risultati indicano che la valutazione dei CNA a livello genico dei tumori può fornire maggiori informazioni prognostiche rispetto al semplice screening per le mutazioni del TP53 o alla misurazione dei livelli di massa dell’aneuploidia tumorale(file supplementare 5).

I CNA focali in genere lasciano presagire una prognosi peggiore di quella di un ampio CNA

Ci siamo quindi posti l’obiettivo di determinare se le alterazioni del numero di copie focali e le alterazioni generali del numero di copie possano avere effetti distinti sull’esito del paziente. Per indagare questa possibilità, abbiamo confrontato il potere prognostico delle CNA focali (definite come un’alterazione ≤3 Mb di lunghezza; Krijgsman et al., 2014) e delle CNA ampie (definite come tutte le alterazioni >3 Mb di lunghezza). Tra i loci in cui sono state osservate sia le alterazioni ampie che quelle focali, abbiamo spesso riscontrato che le CNA ampie erano associate ad esiti moderatamente peggiori, mentre le CNA focali erano associate a bruschi cali di sopravvivenza(Figura 3A-B). In alcuni loci, le CNA ampie hanno avuto esiti indistinguibili dai tumori copy-neutrali, mentre solo le CNA focali sono state associate alla morte(Figura 3C). Raramente abbiamo rilevato casi in cui le CNA ampie indicavano una prognosi peggiore di un’alterazione focale(Figura 3A). Interpretiamo questi risultati come un riflesso delle sanzioni di fitness indotte dall’aneuploidia(Sheltzer et al., 2017; Sheltzer e Amon, 2011): le grandi alterazioni del numero di copie cambiano il dosaggio di più geni contemporaneamente e possono compromettere la crescita del tumore, mentre le alterazioni mirate che colpiscono specificamente il numero di copie del gene guida massimizzano il potenziale maligno.

Le CNA focali influenzano l’esito del paziente modificando i livelli di espressione dei geni wild-type

Le alterazioni del numero di copie genetiche si traducono tipicamente in una variazione proporzionale dell’espressione dei loci interessati(Pollack et al., 2002; Stingele et al., 2012; Williams et al., 2008), sebbene siano stati segnalati casi di compensazione del dosaggio(Gonçalves et al., 2017). Per testare gli effetti dei CNA prognostici sull’espressione genica, abbiamo confrontato i livelli di trascrizione e le variazioni del numero di copie geniche a 40 loci prognostici e abbiamo trovato una correlazione significativa tra i due al 98% dei geni analizzati(Figura 3-figure supplement 3). Successivamente, abbiamo cercato di scoprire se queste alterazioni del numero di copie erano mortali perché aumentavano o diminuivano l’espressione dei prodotti genici mutanti. In altre parole, abbiamo potuto osservare che l’amplificazione di un gene pilota è prognostica solo nei tumori in cui anche quel gene pilota è mutato. È interessante notare che non è così: al 95% dei nostri loci di prova, il numero di copie geniche è rimasto prognostico in modelli multivariati che includevano anche lo stato di mutazione genica(Figura 3D). Per esempio, nel cancro colorettale, l’amplificazione dell’EGFR era associata alla morte anche nei tumori che non presentavano mutazioni EGFR(Figura 3E). In totale, questi risultati indicano che anche in loci con mutazioni ricorrenti, i cambiamenti nell’espressione del gene wild-type possono avere un profondo effetto sul comportamento delle cellule tumorali. Insieme alla nostra osservazione che i cambiamenti focali tendono a conferire una prognosi peggiore rispetto ai cambiamenti generali, questi risultati supportano il modello recentemente proposto di “isola del gene del cancro” dell’evoluzione del genoma tumorale (discusso in dettaglio più avanti; Solimini et al., 2012).

Coorti di pazienti indipendenti verificano il significato prognostico dei CNA del gene guida

Per determinare la generalità delle nostre scoperte, abbiamo raccolto coorti di pazienti indipendenti che ospitano mutazioni o copiano dati numerici legati all’esito della sopravvivenza(file supplementare 1). Abbiamo quindi eseguito un’analisi dei pericoli proporzionali Cox univariata su queste coorti di “validazione” e abbiamo confrontato i risultati con i punteggi Z ottenuti dal nostro set di dati TCGA “discovery”. In primo luogo, abbiamo identificato le mutazioni prognostiche all’interno di un insieme di 16 coorti di pazienti dell’International Cancer Genome Consortium (ICGC), che comprende 3054 pazienti analizzati con il sequenziamento del genoma intero o dell’intero esoma. Nel complesso, le frequenze di mutazione e i punteggi Z delle mutazioni ricorrenti erano molto simili tra le coorti ICGC e TCGA (R = 0,67, p < 0,0001, e R = 0,56, p < 0,0001, rispettivamente; Figura 4A-B). Coerentemente con la nostra analisi TCGA, le mutazioni nel TP53 sono state associate al risultato in più coorti di pazienti rispetto a qualsiasi altro gene(Figura 4C e Figura 1-figure supplement 3C-D). Altre mutazioni, anche nei geni guida del cancro noti, sono state raramente associate all’esito in singoli tipi di cancro e hanno avuto un significato minimo di pan-cancro(Figura 4D-F e file supplementare 6). Mutazioni in KRAS, PIK3CA, BRAF, APC, PTEN, CDKN2A, e molte altre sono state osservate frequentemente, ma non sono mai state correlate con l’esito(Figura 4D). Abbiamo poi analizzato 2431 ulteriori pazienti con dati di CNA curata da cBioportal, e trovato numerose amplificazioni e delezioni associate alla mortalità del paziente(file supplementare 6C). Nel cancro al seno, abbiamo trovato amplificazioni prognostiche che erano incentrate sugli oncogeni, tra cui ERBB2, MYC e MDM2, mentre le delezioni prognostiche comprendevano i soppressori tumorali CDKN2A, PTEN e TP53 (Figura 4G). Nel complesso, abbiamo osservato una correlazione altamente significativa tra i punteggi meta-Z ottenuti dai set di dati TCGA e cBioportal (R = 0,42; Figura 4H) . Infine, nelle coorti di pazienti sottoposti sia all’analisi delle mutazioni che all’analisi del numero di copie, abbiamo verificato che le CNA nei geni pilota hanno comunemente un significato prognostico maggiore rispetto alle mutazioni in quegli stessi geni(Figura 4I). Ad esempio, nel carcinoma mammario, tra i 25 geni frequentemente mutilati, le mutazioni in soli due geni(TP53 e GATA3) hanno mostrato un significato prognostico, mentre i CNA in 12 di quegli stessi geni sono stati associati all’esito del paziente(Figura 4J). In totale, queste analisi suggeriscono che i modelli di sopravvivenza scoperti nel set di dati TCGA sono conservati in coorti indipendenti di pazienti affetti da cancro. In particolare, mentre le mutazioni nella maggior parte dei geni guida del cancro sono non prognostiche, le alterazioni del numero di copie in questi stessi geni sono strettamente legate all’esito del paziente.

Identificazione incrociata di biomarcatori prognostici ad alta fiducia

Al fine di scoprire i biomarcatori con la maggiore rilevanza clinica potenziale, abbiamo poi identificato le mutazioni individuali e i CNA che sono stati costantemente associati al risultato attraverso coorti di pazienti indipendenti. Per aumentare la nostra capacità di rilevare queste alterazioni genetiche, abbiamo eseguito un’analisi di sopravvivenza su un ulteriore set di 2701 tumori primari sottoposti a sequenziamento mirato e analisi del numero di copie (MSKCC_2017; file supplementare 7)(Zehir et al., 2017), su 2431 pazienti di coorti cBioportali i cui tumori erano stati sequenziati(file supplementare 6D), e su 628 pazienti di coorti ICGC sottoposti ad analisi del numero di copie(file supplementare 6B). Il nostro set di dati combinati dei pazienti comprendeva quindi da due a sei coorti indipendenti da ciascuno dei 13 tipi di cancro comuni, per un totale di 16.580 pazienti. Queste coorti sono state raccolte in diversi luoghi, in diverse popolazioni di pazienti, utilizzando diversi disegni di studio, e i campioni sono stati analizzati utilizzando diverse tecnologie genomiche. Abbiamo ragionato che le alterazioni che sono state associate in modo coerente con l’esito, nonostante queste differenze significative, rappresenterebbero biomarcatori altamente penetranti della prognosi dei pazienti. Per identificare tali alterazioni, abbiamo esaminato i biomarcatori che erano associati all’esito (|Z| > 1,96) in ≥2 coorti indipendenti, e che erano altamente significativi (|meta-Z| > 3,3) in tutte le coorti disponibili. Questo approccio ha rivelato molteplici biomarcatori genetici di alta fiducia del risultato della paziente che, a nostra conoscenza, erano nuovi, tra cui amplificazioni MDM4 nel cancro alla prostata, amplificazioni NOTCH2 nel melanoma, e 2q32 delezioni nel cancro ovarico(file supplementare 8). Questi robusti biomarcatori hanno permesso una notevole stratificazione del rischio per la paziente, e i CNA con punteggio massimo sono rimasti prognostici in modelli multivariati che includevano criteri prognostici comunemente misurati (punteggio di Gleason nel cancro della prostata, sierologia dell’epatite nel cancro del fegato, ecc; Figura 5-figure supplement 1). Coerentemente con le nostre analisi a coorte singola, i CNA prognostici a coorte incrociata erano significativamente più comuni delle mutazioni prognostiche, e il TP53 era l’unico gene il cui stato di mutazione era associato all’esito in più di un tipo di cancro(Figura 5-figure supplement 2A).

Alcuni biomarcatori prognostici sono anche associati a vulnerabilità terapeutiche uniche

Abbiamo ipotizzato che alcune alterazioni genetiche sufficienti ad influenzare la sopravvivenza complessiva del paziente potrebbero avere un impatto anche su altri aspetti del comportamento oncologico, tra cui, potenzialmente, la sensibilità ai farmaci. In altre parole, i biomarcatori che contengono informazioni prognostiche significative potrebbero potenzialmente contenere anche informazioni predittive. Abbiamo quindi cercato di scoprire se le alterazioni genetiche che hanno guidato la malattia aggressiva potessero anche sensibilizzare i tumori dei pazienti a specifici regimi terapeutici. Analizzando una coorte di 1000 xenotrapianti derivati da pazienti (PDX), abbiamo identificato diversi casi in cui i biomarcatori ad alta fiducia erano associati alla vulnerabilità a particolari agenti anti-cancro(Gao et al., 2015a). Per esempio, abbiamo identificato le delezioni di Chr9 che comprendevano il CDKN2A come un biomarcatore robusto per una prognosi sfavorevole nel cancro al seno(file supplementare 8). Abbiamo scoperto che i PDX che ospitano delezioni di CDKN2A erano profondamente sensibili alla terapia combinata con un inibitore CDK4/6 e un inibitore mTOR(Figura 5-figure supplement 2B), coerente con il fatto che una proteina codificata da CDKN2A , p16, funziona come un inibitore naturale di CDK4/6 (Serranoet al., 1993), p. 4). Al contrario, altri biomarcatori associati ad una prognosi sfavorevole nel cancro al seno non sono riusciti a prevedere la sensibilità a questa combinazione di trattamento, ma sono invece correlati alla sensibilità ad altri agenti(fascicolo supplementare 8). A causa del numero limitato di farmaci testati nei PDX, abbiamo ampliato la nostra ricerca di target per includere un profilo farmacogenomico recentemente descritto delle linee cellulari tumorali e abbiamo scoperto diverse vulnerabilità aggiuntive dei biomarcatori(Figura 5A-B). Per esempio, abbiamo identificato le mutazioni in STAG2 come un biomarcatore di alta fiducia di una prognosi sfavorevole nel glioma, e abbiamo scoperto che i gliomi STAG2-mutanti sono squisitamente sensibili al trattamento con l’inibitore PARP olaparib (Figura 5A). In totale, abbiamo identificato vulnerabilità terapeutiche altamente significative per il 49% dei biomarcatori prognostici scoperti dalla nostra analisi integrata, fornendo potenziali strategie per trattare un sottoinsieme di pazienti che hanno i tumori più aggressivi.

Discussione

La medicina moderna ha notevolmente prolungato la sopravvivenza di individui con diagnosi di cancro(Johnson et al., 2017). Tuttavia, l’evidenza crescente suggerisce che ampi sottoinsiemi di pazienti ricevono cure non ottimali e sono sottoposti a un trattamento eccessivo o insufficiente rispetto al loro livello di rischio(Bhatt e Klotz, 2016; Esserman et al., 2013; Swaminathan e Swaminathan, 2015). Ad oggi, molte delle alterazioni genetiche che differenziano i tumori mortali e quelli benigni sono rimaste oscure. La nostra analisi dei biomarcatori prognostici di 17.879 pazienti fa luce su queste differenze genetiche, identifica un sottoinsieme di pazienti che possono beneficiare maggiormente di un intervento aggressivo e suggerisce strategie terapeutiche per i tumori che ospitano alcune alterazioni associate a una prognosi sfavorevole. Un portale web per facilitare l’accesso a questi risultati è disponibile all’indirizzo http://survival.cshl.edu/.

Poiché i tumori si manifestano a causa dell’accumulo di mutazioni negli oncogeni promotori della crescita e nei soppressori tumorali inibitori della crescita, ci si può aspettare che la presenza e la diversità di queste mutazioni detengano il decorso clinico di un tumore. Tuttavia, i nostri dati suggeriscono che in molti casi non è così. In letteratura esistono sostanziali disaccordi sul valore dei biomarcatori prognostici basati sulle mutazioni, in quanto gli stessi oncogeni driver sono stati segnalati in modo indipendente come caratteristiche prognostiche avverse o non significative(Guan et al., 2013; Marabese et al., 2015; Scoccianti et al., 2012; Sun et al., 2013). In questo manoscritto, abbiamo eseguito un’analisi imparziale a livello genomico di set di dati pubblici con dimensioni del campione prestabilite. Questo approccio può quindi aggirare alcuni problemi, tra cui il test di ipotesi post-hoc, il bias di selezione dei pazienti e il “problema del cassetto dei file”, che può confondere gli studi mirati sui biomarcatori (Aronson,2005; Ensor, 2014; Goossens et al., 2015; Rosenthal, 1979; Scargle, 1999). Riteniamo possibile che, con campioni di dimensioni maggiori o sottotipi tumorali più specifici, si possano identificare ulteriori mutazioni prognostiche. È importante notare che nella maggior parte delle coorti di pazienti che abbiamo raccolto, i tumori sono stati analizzati su piattaforme genomiche multiple, e i CNA erano comunemente prognostici nelle stesse coorti in cui le mutazioni geniche non lo erano. Questi risultati sottolineano la nostra capacità di individuare con successo i biomarcatori in coorti di queste dimensioni e suggeriscono che, in un confronto testa a testa, le alterazioni del numero di copie forniscono informazioni prognostiche più utili rispetto alle mutazioni di un singolo gene.

Mentre abbiamo identificato pochissime mutazioni associate all’esito del paziente, diverse linee di evidenza sottolineano i potenziali benefici di un continuo sforzo di sequenziamento clinico. In primo luogo, la nostra analisi ha rivelato un sottoinsieme di mutazioni con potere prognostico specifico dei tessuti, tra cui mutazioni TP53 nel cancro al seno, mutazioni RB1 nel cancro della vescica e mutazioni FBXW7 nel cancro colorettale. In secondo luogo, la maggior parte dei pazienti delle coorti TCGA sono stati trattati con farmaci citotossici standard. Poiché le terapie mirate e le immunoterapie sono sempre più adottate nella clinica, le mutazioni oncogenetiche non prognostiche nei set di dati qui analizzati possono essere in grado di prevedere la sensibilità a specifici agenti terapeutici(Gagan e Van Allen, 2015). In terzo luogo, i tumori stessi sono composti da popolazioni subclonali che ospitano serie distinte di mutazioni, e recenti evidenze suggeriscono che l’eterogeneità del cancro può influenzare il decorso clinico(Jamal-Hanjani et al., 2017). Quindi, interrogando lo spettro delle mutazioni a livello subclonale si possono identificare mutazioni prognostiche non distinte nelle analisi di massa.

Sebbene i cambiamenti su larga scala nella ploidia tumorale siano stati precedentemente riconosciuti come un indicatore di scarso esito(Friedlander et al., 1984; Kallioniemi et al., 1987; Kokal et al., 1986; Merkel e McGuire, 1990; Zimmerman et al., 1987), i contributi delle alterazioni del numero di copie nella maggior parte dei singoli geni sono rimasti inesplorati. Nonostante il limitato valore di stratificazione delle mutazioni nei geni guida del cancro, abbiamo scoperto che le alterazioni del numero di copie di molti di questi stessi geni sono ampiamente prognostiche. I CNA focali tendevano a conferire una prognosi peggiore di quella di un ampio CNA, in linea con un modello in cui gli squilibri di dosaggio dei geni su larga scala innescano uno stress proteotossico e impongono una penalità di fitness alle cellule tumorali(Santaguida e Amon, 2015; Sheltzer e Amon, 2011). Inoltre, mentre i CNA prognostici comunemente causavano cambiamenti proporzionali nell’espressione del gene target, la maggior parte dei CNA restavano prognostici indipendentemente dal fatto che influissero o meno sull’espressione di un gene mutato. Questi risultati supportano un modello di tumorigenesi “isola genica del cancro” o “aneuploidia cumulativa”, in cui i tumori accumulano una serie di cambiamenti limitati del numero di copie che interessano regioni aplo-sensibili e triplo-sensibili (Davoli et al.,2013; Solimini et al., 2012). L’identificazione delle conseguenze funzionali di questi CNA prognostici sulla fisiologia tumorale è un obiettivo chiave per il futuro.

I pazienti i cui tumori ospitano alterazioni genetiche che causano la mortalità hanno urgente bisogno di migliorare le opzioni di trattamento. Abbiamo scoperto molti casi in cui i biomarcatori ad alta fiducia della malattia aggressiva hanno sensibilizzato i tumori a specifiche terapie antitumorali. Approfittando di queste vulnerabilità, un approccio di precisione-medicina potrebbe essere applicato sia per stratificare il rischio del paziente sia per identificare le combinazioni di farmaci più probabili per fornire un beneficio clinico. Diverse sensibilità previste dal nostro lavoro hanno un supporto clinico o meccanicistico, tra cui l’uso di inibitori CDK4/6 per il trattamento dei tumori CDKN2A, l’uso di inibitori PARP per il trattamento dei tumori STAG2-mutanti, e l’uso di inibitori SYK per il trattamento dei tumori RB1-mutanti(Bailey et al., 2014; Gao et al., 2015b; Zhang et al., 2012). Il trattamento con agenti mirati altera significativamente il paesaggio epigenetico e genetico cellulare, spesso culminando nello sviluppo di resistenze alle terapie applicate(Holohan et al., 2013). Si ipotizza che le alterazioni secondarie che i tumori evolvono per tollerare questi farmaci potrebbero anche alterare o smussare il fenotipo aggressivo causato dall’alterazione del driver originale. In questo modo, prendere di mira un biomarcatore che conferisce una prognosi sfavorevole potrebbe sia direttamente portare a un miglioramento degli esiti dei pazienti, innescando una robusta risposta clinica, sia indirettamente aiutare i pazienti, costringendo l’evoluzione del tumore ad abbandonare la dipendenza da un driver di malattia aggressivo.

Materiali e metodi

Fonti di dati

Le coorti di pazienti analizzate in questo studio sono elencate nel file supplementare 1. Per l’analisi TCGA sono stati utilizzati i file pre-processati dal Broad Institute TCGA Firehose(https://gdac.broadinstitute.org/). Per l’analisi del numero di copie genomiche TCGA, abbiamo usato gli SCNA segmentati HG19, corretti per gli SCNA germline. Il tempo di sopravvivenza globale è stato utilizzato come endpoint clinico per tutti i tipi di cancro ad eccezione del PRAD. La sopravvivenza globale è stata scelta perché riflette un evento obiettivo e non ambiguo, è lo standard d’oro per gli studi clinici oncologici ed è ampiamente disponibile in diversi studi(Driscoll e Rixe, 2009). Tuttavia, poiché meno del 2% dei pazienti della coorte PRAD è deceduto durante il periodo di follow-up, come endpoint surrogato è stato utilizzato il termine “giorni alla ricorrenza biochimica”. Per tutti i tumori, la sopravvivenza o il tempo di follow-up dalla diagnosi sono stati corretti per i giorni al prelievo del campione. I tumori primari (indicati con un ’01’ nel codice a barre del paziente) sono stati utilizzati per ogni tipo di tumore ad eccezione della SKCM; per questo tumore, erano disponibili pochi campioni primari, per cui sono stati inclusi campioni metastatici (indicati con un ’06’ nel codice a barre) per i pazienti in cui non era disponibile un tumore primario. Per ulteriori discussioni sui campioni TCGA, vedere il testo supplementare 2. La frazione di cellule tumorali valutata in base alla patologia è stata ottenuta dai file clinici del TCGA sotto “Percent_tumor_cells”. Lo stadio e il grado del tumore sono stati ottenuti in modo simile dai file clinici TCGA appropriati.

La mutazione, il numero di copia e i dati clinici della Release 25 dell’International Genome Consortium sono stati scaricati dal Portale Dati ICGC(Zhang et al., 2011). La sopravvivenza globale è stata utilizzata come endpoint clinico per tutte le coorti ad eccezione dell’EOPC-DE; a causa dei pochi decessi in questa coorte, la sopravvivenza senza recidiva è stata utilizzata come endpoint. Le coorti sono state scelte in base alla disponibilità di dati WGS o WES, e sono state incluse se provengono da un tipo di cancro paragonabile ai tipi studiati nella nostra analisi TCGA.

Il numero di copie, la mutazione e i dati clinici di cBioportal sono stati scaricati come file pre-processati da www.cbioportal.org (Gao et al., 2013). Per i pazienti descritti in Zehir et al. (2017) (le coorti cBioportal/MSKCC_2017), sono stati inclusi solo i tumori primari per tutti i tipi di cancro ad eccezione del melanoma.

Strategia di analisi globale

Tutte le elaborazioni e le analisi sono state eseguite utilizzando Python. L’analisi del pericolo proporzionale Cox ha utilizzato il pacchetto di sopravvivenza R(https://cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html) per calcolare i punteggi Z e i valori p. La giustificazione e ulteriori spiegazioni per l’uso della modellazione dei pericoli proporzionali Cox si trovano nel testo supplementare 1. Il progetto rpy2 è stato utilizzato per controllare R dal pitone, consentendo una perfetta integrazione dei calcoli dei punteggi Z con l’elaborazione dei dati e l’analisi del pan-cancro. I DataFrame Pandas sono stati utilizzati come struttura primaria per la memorizzazione e la manipolazione dei dati. Inoltre, sono stati utilizzati occasionalmente metodi e array nativi numpy per l’archiviazione efficiente di dati strettamente numerici, ad esempio, come input per i modelli di pericolo proporzionali Cox. Il pacchetto statsmodels(www.statsmodels.org) è stato utilizzato per la correzione delle false scoperte con la procedura Benjamini-Hochberg. Microsoft Excel è stato usato occasionalmente per l’elaborazione e l’esame finale dei dati, per cui è stato aggiunto un singolo apostrofo prima dei nomi dei geni nelle fasi intermedie di elaborazione dei dati per proteggere i geni dall’autoformattazione(Zeeberg et al., 2004).

Il codice è stato strutturato in modo da consentire la facilità di riutilizzo interno e la riproducibilità dei risultati. I metodi di analisi di Cox univariate proportional hazards, Cox univariate proportional hazards, Cox multivariate proportional hazards, Kaplan-Meier e Stouffers sono stati inseriti in una libreria di analisi, prendendo come input i dati necessari per eseguire il calcolo come array numpy o panda DataFrames.

Analisi TCGA

Oltre al codice per le analisi statistiche, il codice per l’elaborazione dei file clinici TCGA è stato inserito in una biblioteca comune. Questo approccio ha permesso di eseguire lo stesso codice per l’elaborazione dei file clinici TCGA attraverso una varietà di analisi di piattaforma, garantendo un comportamento identico per ogni piattaforma. Il codice di elaborazione clinica TCGA ha selezionato gli endpoint clinici rilevanti e i dati di approvvigionamento del campione. L’elaborazione ha tradotto i dati clinici disponibili nel formato richiesto per i modelli di pericolo proporzionali Cox: un valore di endpoint/tempo di sopravvivenza e un valore di censura per ogni paziente. In questa libreria è stato incluso anche il codice per selezionare i campioni tumorali in base al tipo di tumore.

I dati di input grezzi per l’analisi della mutazione necessitavano di un ulteriore pretrattamento prima di poter costruire i modelli di pericolo proporzionali di Cox. Questo pretrattamento comprendeva la rimozione delle intestazioni per paziente in tutto il dato e la trasposizione di alcuni dati. Per tutte le analisi che utilizzano i dati delle mutazioni TCGA, sono state escluse le mutazioni annotate come mute. I geni sono stati inclusi nelle analisi a valle solo se sono stati mutati nel 2% o più dei pazienti in una coorte di tipo tumorale.

Anche i dati di input grezzi per l’analisi del numero di copie hanno richiesto una sostanziale pre-elaborazione. I dati di input del numero di copia sono costituiti da mappe di localizzazione per paziente e per cromosoma dei numeri di copia (hg19 scaricato dal Genoma Browser UCSC; Tyner et al., 2017). Queste mappe sono state convertite in un singolo valore di numero di copia per ogni gene. Abbiamo creato un albero di intervallo (usando il pacchetto intervaltree python, https://pypi.python.org/pypi/intervaltree) delle mappe di localizzazione per ogni cromosoma e abbiamo usato l’HGNC appropriato per convertire le posizioni dei cromosomi in geni per ogni paziente. Abbiamo usato la posizione del sito di partenza trascrizionale del gene per cercare nell’albero degli intervalli il valore del numero di copia di un gene. Questa analisi ha prodotto un file intermedio di forma simile alle altre piattaforme TGCA, che ha permesso una semplice analisi Cox. Si noti che i modelli di pericolo proporzionali Cox sono un metodo indipendente dalla soglia per eseguire l’analisi di sopravvivenza, e quindi non è stata specificata alcuna soglia minima o massima per l’alterazione del numero di copie.

Un tumore è stato definito come avente un’amplificazione o una delezione focale se il suo numero di copie era superiore a 0,3 o inferiore a -0,3, e l’intervallo cromosomico con un numero di copie superiore all’80% del numero di copie al gene di interesse era inferiore o uguale a 3 Mb (Krijgsmanet al., 2014).

Per calcolare il numero di alterazioni strutturali per tumore, è stato sommato per ogni paziente il numero di valori distinti del numero di copie per cromosoma nel file di segmentazione del DNA.

Analisi TCGA pan-cancro

Per ogni piattaforma e tipo di analisi, abbiamo eseguito un’analisi pan-cancro. Questa analisi ha creato un singolo punteggio Z per ogni gene combinando i punteggi Z per ogni tipo di cancro utilizzando il metodo Stouffer. Per eseguire il metodo Stouffer, abbiamo preso la somma dei punteggi Z per un singolo gene e abbiamo diviso tale somma per la radice quadrata del numero di tipi di cancro con i punteggi Z per il gene (Stouffer, 1949). Questo punteggio meta-Z è stato poi confrontato con i punteggi meta-Z ottenuti in modo simile da altre analisi della piattaforma.

Ulteriori analisi della mutazione TCGA

Abbiamo eseguito diverse analisi aggiuntive sui dati delle mutazioni, tra cui i punteggi della combinazione di doppia mutazione Z, i punteggi del codice hotspot Z e i punteggi Z corretti per i VAF. Per i punteggi Z della doppia mutazione, abbiamo preso i 30 geni più comuni dei driver per il cancro ed eseguito combinazioni a coppie. Abbiamo poi calcolato i rischi proporzionali di Cox per ogni coppia di geni, in cui si considerava che un paziente avesse una mutazione a coppie se e solo se entrambi i geni erano stati mutati in modo non silenzioso per quel paziente. I punteggi Z sono stati calcolati per una coppia solo se (1) nessuno dei due geni della coppia era statisticamente significativo da solo nell’analisi univariata e (2) se entrambi i geni sono stati mutati insieme in almeno 10 pazienti.

I punteggi Z per codice sono stati calcolati per un insieme selezionato di codici hotspot. La maggior parte dei tipi di cancro erano disponibili in HG37, quindi le posizioni di mutazione HG37 sono stati utilizzati per individuare i codoni. Le mutazioni per OV e COADREAD erano disponibili solo in HG36, quindi le posizioni dei geni sono state convertite in HG37 prima dell’elaborazione del codone. I punteggi per il codone Z sono stati calcolati identificando prima i pazienti con mutazioni nel gene rilevante, quindi selezionando da quell’insieme di pazienti quelli le cui mutazioni erano nel codone di interesse. Se il 2% o più dei pazienti aveva mutazioni nel codone selezionato, è stato calcolato un punteggio Z.

I VAF sono stati calcolati per 10 dei tipi di cancro TCGA. Abbiamo analizzato i dati VAF in due modi. In primo luogo, abbiamo calcolato i punteggi Z, contando solo un gene come mutato se il suo VAF era maggiore o uguale a 0,4. In secondo luogo, abbiamo identificato il punteggio VAF mediano per ogni gene, e abbiamo calcolato i punteggi Z contando solo un gene come mutato se il suo VAF era uguale o superiore al VAF mediano per quel gene.

Analisi CBioPortale

CBioPortal è stato strutturato in modo simile alle analisi TCGA, anche se l’elaborazione dei dati non è stata considerata in una libreria indipendente, poiché ciascuno di questi set di dati è stato utilizzato in una sola analisi. I dati dei numeri di copia da un tipo di cancro del CBioPortal, blca_mskcc, richiedevano una pre-elaborazione iniziale nel modo descritto sopra per i numeri di copia TCGA. Le mutazioni sono state incluse se sono state annotate come uno di questi tipi: In_Frame_Ins, Nonstop_Mutation, Translation_Start_Site, In_Frame_Del, Splice_Region, Frame_Shift_Ins, Frame_Shift_Del, Splice_Site, Nonsense_Mutation, o Missense_Mutation.

Analisi ICGC

L’analisi ICGC è stata strutturata in modo simile all’analisi CBioPortal. Le mutazioni sono state incluse nelle analisi a valle solo se sono state annotate come uno di questi tipi: cancellazione dirompente dell’inframe, inserimento dirompente dell’inframe, variante frameshift, cancellazione dell’inframe, variante missense, variante accettatore di giunzioni, variante donatore di giunzioni, stop guadagnato, o stop perso. I punteggi Z sono stati calcolati se un gene è stato mutato nel 2% o più dei pazienti di una particolare coorte.

Identificazione di biomarcatori di alta fiducia associati a sensibilità ai farmaci

Attraverso set di dati indipendenti, sono state identificate coorti di pazienti con tipi di cancro correlati. Sono state determinate mutazioni o CNA significativamente associate alla prognosi del paziente (Z > 1,96 o Z < -1,96) in due o più coorti indipendenti da ciascun tipo di cancro. Poi, il sottoinsieme di queste alterazioni che sono rimaste altamente significative (Z > 3,3 o Z < -3,3) in tutte le coorti dello stesso tipo di cancro sono stati classificati come biomarcatori di alta fiducia. In alcuni casi, le amplificazioni che si estendevano a regioni cromosomiche continue sono risultate correlate alla prognosi del paziente. Questi segmenti sono stati identificati manualmente. Per la determinazione della sensibilità terapeutica descritta di seguito, il gene con il punteggio minimo di meta-Z (per le delezioni) o massimo di meta-Z (per le amplificazioni) all’interno di un segmento è stato scelto per rappresentare il segmento nel suo insieme.

I dati di sensibilità terapeutica per i PDX sono stati acquisiti da(Gao et al., 2015a). Per identificare le mutazioni correlate alla sensibilità terapeutica, per ogni farmaco o combinazione di farmaci, è stato effettuato un confronto se cinque o più PDX avevano una mutazione in un gene di interesse e se cinque o più PDX erano di tipo selvaggio per un gene di interesse. Per i geni e le terapie che rispondevano a questi criteri, abbiamo poi identificato i casi in cui la terapia ha portato a una risposta clinica nella popolazione mutante, definita come una crescita media della “migliore risposta media”<15% di crescita tumorale tra i PDX con una mutazione nel gene di interesse. Infine, per i geni e le terapie che soddisfano questi criteri, abbiamo eseguito un t-test per la ‘Miglior risposta media’ tra PDX con copie mutanti e wild-type di un gene di interesse. Abbiamo riportato terapie in cui questi criteri sono stati soddisfatti e i tumori con mutazione erano più sensibili alla terapia rispetto ai tumori con copie wild-type del gene di interesse (p < 0,01).

Per identificare i CNA correlati alla sensibilità della terapia nella coorte PDX, sono state chiamate le amplificazioni e le delezioni (CNA >|.3|), che sono state poi considerate separatamente. Come sopra, le CNA sono state incluse se cinque o più PDX mostravano un’alterazione, e se cinque o più PDX non mostravano tale alterazione. Per i geni e le terapie che si adattavano a questi criteri, abbiamo poi identificato i casi in cui la terapia risultava in una risposta clinica nella popolazione alterata, definita come una media di ‘Migliore risposta media’<15% di crescita tumorale tra i PDX con un’amplificazione o delezione nel gene di interesse. Infine, per i geni e le terapie che soddisfano questi criteri, abbiamo eseguito un t-test per la ‘Miglior risposta media’ tra PDX con copie mutanti e wild-type di un gene di interesse. Abbiamo riportato terapie in cui questi criteri sono stati soddisfatti e i tumori con una mutazione erano più sensibili alla terapia rispetto ai tumori con copie wild-type del gene di interesse (p < 0,01).

I dati sulla sensibilità terapeutica delle linee cellulari tumorali sono stati acquisiti da(Iorio et al., 2016). Per questi dati sono stati utilizzati due diversi confronti. In primo luogo, i calcoli descritti di seguito sono stati eseguiti per le linee cellulari dal tipo di cancro specifico che il biomarcatore di alta fiducia è stato identificato in. Se questa analisi non ha prodotto vulnerabilità significative, i calcoli sono stati ripetuti per tutti i tipi di cancro (pan-cancro).

Le mutazioni di alta fiducia sono state valutate se cinque o più linee cellulari nell’insieme di interesse avevano una mutazione non sinonima in quel gene, e se cinque o più linee cellulari avevano copie wild-type di quel gene. Le CNA sono state valutate se cinque o più linee cellulari avevano un’alterazione (delezione o amplificazione) di quel gene, e se cinque o più linee cellulari non avevano tale alterazione. Per ogni confronto, i test T sono stati eseguiti tra il valore log(IC50) di ogni composto testato. Per le analisi di tipo monocancro, è stata utilizzata una soglia di p < 0,01 per identificare la significatività, mentre per le analisi di tipo pan-cancro, è stata utilizzata una soglia di p < 0,0001 per identificare la significatività.

Codice

Il codice è disponibile su GitHub all’indirizzo https://github.com/joan-smith/genomic-features-survival ( Smith, 2018; copia archiviata all’indirizzo https://github.com/elifesciences-publications/genomic-features-survival).

Analisi Kaplan-Meier

Le trame di Kaplan-Meier sono state generate utilizzando il prisma del Graphpad. Le cancellazioni e le amplificazioni nei grafici Kaplan-Meier corrispondono a CNA > |0.3|; le cancellazioni profonde e i guadagni ad alta copia corrispondono a CNA > |1|. I valori P riportati nei grafici KM sono stati generati dal test log-rank in Prisma. Si noti che i grafici Kaplan-Meier sono visualizzati in questo manoscritto principalmente per la facilità di visualizzazione dei risultati dei pazienti. I punteggi Z sono stati sempre generati con la modellazione dei pericoli proporzionali Cox, che non richiede la selezione di cut-off artificiali o soglie per i dati continui.

Ulteriori fonti di dati e strumenti

I 30 geni guida del cancro frequentemente mutilati sono stati acquisiti da(Zehir et al., 2017). Le statistiche NCI-SEER sono state scaricate da https://seer.cancer.gov. I punteggi totali di aneuploidia tumorale, i valori di purezza determinati in modo ASSOLUTO e l’infiltrazione dei leucociti sono stati ottenuti da(Taylor et al., 2018). Campioni iper-mutate sono stati ottenuti da(Bailey et al., 2018). Le trame dei lecca-lecca sono state generate utilizzando il software Lollipops(Jay e Brouwer, 2016). I diagrammi di densità sono stati generati con script Python utilizzando matplotlib(https://matplotlib.org/). Le mutazioni di una singola coppia di basi sono state mappate su codici utilizzando PolyPhen-2(Adzhubei et al., 2010).

Testo supplementare 1. Modellazione dei pericoli proporzionali Cox

Sono state sviluppate diverse tecniche statistiche per eseguire analisi di sopravvivenza o di “time-to-failure” (riviste in Kleinbaum e Klein, 2012). Queste includono l’analisi Kaplan-Meier, la regressione proporzionale dei pericoli Cox, la modellazione accelerata del tempo di guasto e molte altre. In questo articolo, abbiamo scelto di applicare la regressione proporzionale dei pericoli Cox per analizzare i dati sulla sopravvivenza al cancro. Il modello Cox è rappresentato dalla seguente funzione:ht,X=h0(t)e∑i=1nβiXi

Dove t è il tempo di sopravvivenza, h(t, X) è la funzione di pericolo, h0(t) è il pericolo di base,_Xi è una potenziale variabile prognostica, e β i indica la forza dell’associazione tra una variabile prognostica e la sopravvivenza. In questo modello, i pazienti hanno un rischio di morte di base, dipendente dal tempo [h0(t)], modificato da caratteristiche prognostiche indipendenti dal tempo che aumentano (β i>0) o diminuiscono (β i<0) il rischio_di morte. In questo lavoro, riportiamo i punteggi Z, che sono calcolati dividendo il coefficiente di regressione (β i)_per il suo errore standard.

La modellazione dei pericoli proporzionali Cox è stata scelta per diversi motivi. In primo luogo, a differenza dell’analisi Kaplan-Meier, i modelli Cox non richiedono la selezione di una soglia o di un cut-off, quindi i dati continui come i valori di espressione genica non devono essere dicotomizzati. (Si noti che in questo manoscritto, le trame di Kaplan-Meier sono fornite a scopo di visualizzazione, ma i punteggi Z riportati sono sempre da modelli Cox). In secondo luogo, i modelli Cox possono accettare sia dati di input continui che discreti, consentendo di utilizzare questo approccio per analizzare sia le caratteristiche genomiche binarie (ad esempio, mutante vs. non mutante) che quelle continue (ad esempio, numero di copia del gene). In terzo luogo, i modelli Cox sono suscettibili sia di analisi univariate (i = 1) che multivariate (i > 1). In quarto luogo, la regressione Cox ci permette di calcolare i punteggi Z e un valore p per ogni associazione, poiché i punteggi Z rappresentano il numero di deviazioni standard dalla media di una distribuzione normale. Quinto, i punteggi Z codificano la direzionalità di un’associazione: i fattori prognostici poveri mostreranno valori di β i superiori a 0, mentre i fattori prognostici favorevoli mostreranno valori di β i inferiori a 0. Questo permette di confrontare direttamente le caratteristiche di sopravvivenza “positive” e “negative”. In sesto luogo, i punteggi Z sono utili per le meta-analisi, in quanto possono essere combinati utilizzando il Metodo Stouffer (Stouffer, 1949):Z= ∑i=1nZik

Settimo, la modellazione dei pericoli proporzionali di Cox è comunemente utilizzata sia nelle precedenti analisi di sopravvivenza a livello genomico che in numerosi studi clinici sui biomarcatori(Dhanasekaran et al., 2001; Fukuoka et al., 2011; Gentles et al., 2015; Parker et al., 2009; Wang et al., 2005), facilitando il confronto con altri sforzi di scoperta di biomarcatori.

Per verificare la normalità sottostante dei punteggi Z, abbiamo generato dei grafici qq per i valori del numero di copie geniche(Figura 1-figure supplement 2C). Le distribuzioni risultanti per le CNA erano generalmente lineari, come previsto, con spalle occasionali con punteggi Z bassi e alti. Abbiamo calcolato in modo simile i punteggi Z per tutti i geni che ospitano mutazioni di codifica in sequenza; tuttavia, abbiamo scoperto che questo ha portato a plateau intorno all’origine in più tipi di cancro. Queste aberrazioni sono state causate dal verificarsi di mutazioni rare e casuali in geni multipli che non avevano alcun potere prognostico. Per eliminare questi altipiani, abbiamo sperimentato diverse soglie per l’analisi delle mutazioni. Considerando solo le mutazioni che si sono verificate in una certa percentuale di pazienti affetti da cancro, la comparsa degli altipiani è diminuita, ma soglie elevate hanno anche eliminato dalla considerazione le mutazioni in un certo numero di fattori cancerogeni noti. Abbiamo selezionato una soglia del 2% per bilanciare il mantenimento della normalità della distribuzione del punteggio Z mantenendo anche mutazioni poco frequenti ma significative nei geni dei driver.

Si noti che in molti documenti di analisi della sopravvivenza è inclusa una fase di “selezione delle caratteristiche” per identificare un numero minimo di caratteristiche in grado di identificare accuratamente i pazienti a rischio. Abbiamo eseguito un’analisi imparziale e completa del genoma senza selezione delle caratteristiche, per generare un punteggio Z per ogni gene e per ogni tipo di caratteristica del genoma. In questo lavoro non viene applicata nessuna fase di selezione delle caratteristiche.

Testo supplementare 2. 2. Analisi di sopravvivenza nelle coorti TCGA

Le coorti di pazienti che sono state assemblate per il TCGA sono state raccolte per consentire un’analisi molecolare dei principali sottotipi di cancro riscontrati negli Stati Uniti. Sebbene siano state raccolte informazioni cliniche per quasi tutti i pazienti, queste coorti non sono state scelte specificamente per condurre studi di sopravvivenza. Riteniamo che la nostra analisi di sopravvivenza sia appropriata per diversi motivi. In primo luogo, abbiamo verificato che i tempi di sopravvivenza complessiva dei pazienti all’interno del TCGA sono altamente coerenti con i dati epidemiologici nazionali raccolti dal NCI(Figura 1-figure supplement 2D-E). In secondo luogo, abbiamo scoperto che molti biomarcatori ben consolidati hanno un’importanza prognostica nelle coorti TCGA, comprese le mutazioni IDH1 nel glioma(Figura 1-figure supplement 7), le mutazioniTP53 nel cancro al seno (Figura1-figure supplement 3), lo stadio e il grado deltumore in diversi tipi di cancro (Figura 2-figure supplement 3),e altro ancora. In terzo luogo, abbiamo convalidato i modelli di sopravvivenza che descriviamo nel TCGA in diverse coorti di pazienti indipendenti, indicando che questi non sono fenomeni specifici del TCGA(Figura 4). In quarto luogo, in un’analisi indipendente della qualità delle annotazioni cliniche nel TCGA(Liu et al., In quinto luogo, i nostri sforzi si basano su un solido lavoro che ha anche eseguito analisi di sopravvivenza su coorti TCGA, e, in alcuni casi, risultati simili convalidati dal TCGA in popolazioni di pazienti indipendenti (Andor et al.,2016; Davoli et al., 2017; Gentles et al., 2015; Guinney et al., 2015; Uhlen et al., 2017) . Infine, notiamo che il TCGA presenta diversi vantaggi rispetto agli studi di sopravvivenza standard avviati dagli sperimentatori. I campioni dei pazienti sono stati raccolti e analizzati in modo imparziale, precludendo la possibilità del “problema del cassetto di archiviazione” (mancata pubblicazione di risultati negativi) o dell’adeguamento post-hoc delle dimensioni del campione (terminando l’arruolamento del paziente quando si trova un risultato significativo). Sono disponibili un numero significativamente maggiore di dati molecolari sui tumori TCGA rispetto a qualsiasi altro set di dati di dimensioni comparabili, il che consente di effettuare analisi multivariate e correlazionali di diverse sfaccettature dei genomi tumorali. Tutti i dati del TCGA e tutto il codice di questo manoscritto sono disponibili al pubblico, consentendo una facile replicazione ed estensione su questa analisi.

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Fonte

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