Una mappa di interazione del promotore per la genetica delle malattie cardiovascolari

Abstract

Oltre 500 loci genetici sono stati associati al rischio di malattie cardiovascolari (CVD), tuttavia la maggior parte dei loci si trova in regioni non codificate dal punto di vista genico e i loro geni bersaglio non sono noti. Qui, abbiamo generato mappe ad alta risoluzione di cattura del promotore Hi-C (PCHi-C) nelle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) e nei cardiomiociti derivati da iPSC (CMs) per fornire una risorsa per identificare e dare priorità ai target funzionali delle associazioni CVD. Convalidiamo queste mappe dimostrando che i promotori preferiscono le sequenze distali a contatto arricchite per i motivi dei fattori di trascrizione specifici dei tessuti e sono arricchite per i segni della cromatina che sono correlati con i cambiamenti dinamici nell'espressione genica. Utilizzando la mappa CM PCHi-C, abbiamo collegato 1.999 SNPs associati a CVD a 347 geni target. Notevolmente, oltre il 90% delle interazioni geniche SNP-target non ha coinvolto il gene più vicino, mentre il 40% degli SNPs ha interagito con almeno due geni, dimostrando l'importanza di considerare le interazioni a lungo raggio della cromatina quando si interpretano i target funzionali dei loci della malattia.

Introduzione

Uno dei principali obiettivi della ricerca sulla genetica umana è quello di comprendere i contributi genetici a malattie complesse, in particolare i meccanismi molecolari attraverso i quali le varianti comuni del DNA hanno un impatto sull’eziologia della malattia. La maggior parte degli studi di associazione a livello genomico (GWAS) implica varianti non codificanti che sono lontane dai geni, complicando l’interpretazione della loro modalità d’azione e la corretta identificazione del gene target(Maurano et al., 2012). Le prove di montaggio suggeriscono che le varianti di malattia disturbano la funzione degli elementi regolatori che agiscono sul cis, come gli stimolatori, che a loro volta influenzano l’espressione del gene o dei geni specifici che sono bersagli funzionali di questi elementi(Wright et al., 2010; Musunuru et al., 2010; Cowper-Sal lari et al., 2012; Smemo et al., 2014; Claussnitzer et al., 2015). Tuttavia, poiché gli elementi regolatori ad azione cispossono essere localizzati a distanza di kilobase (kb) dai loro geni target, l’identificazione dei veri obiettivi funzionali degli elementi regolatori rimane una sfida(Smemo et al., 2014).

Le tecniche di cattura della conformazione del cromosoma come Hi-C(Lieberman-Aiden et al., 2009) consentono la mappatura a livello genomico dei contatti a lungo raggio della cromatina e rappresentano quindi una strategia promettente per identificare i bersagli genici distali di varianti genetiche associate alla malattia. Recentemente, le mappe Hi-C sono state generate in numerosi tipi di cellule umane, tra cui le cellule staminali embrionali e i primi lignaggi embrionali(Dixon et al., 2012, 2015), le cellule immunitarie (Rao et al., 2014), i fibroblasti(Jin et al., 2013) e altri tipi di tessuto primario(Schmitt et al., 2016). Tuttavia, nonostante la crescente abbondanza di mappe Hi-C, la maggior parte dei set di dati sono di risoluzione limitata (>40 kb) e non identificano con precisione le regioni genomiche a contatto con i promotori genici.

Più recentemente, è stata sviluppata la cattura dei promotori Hi-C (PCHi-C) che aumenta notevolmente il potere di rilevare le interazioni che coinvolgono le sequenze dei promotori(Schoenfelder et al., 2015; Mifsud et al., 2015). Il PCHi-C in diversi tipi di cellule ha identificato migliaia di contatti tra i promotori e ha rivelato ampie differenze nell’architettura del promotore tra i vari tipi di cellule e nella differenziazione(Schoenfelder et al., 2015; Mifsud et al., 2015; Javierre et al., 2016; Freire-Pritchett et al., 2017; Rubin et al., 2017; Siersbæk et al., 2017). Questi studi hanno dimostrato collettivamente che l’architettura del genoma riflette l’identità delle cellule, suggerendo che i tipi di cellule rilevanti per la malattia sono fondamentali per il successo dell’interrogazione dei meccanismi di regolazione genica dei loci della malattia.

A sostegno di questa idea, diversi studi recenti hanno utilizzato mappe di interazione ad alta risoluzione del promotore per identificare i geni bersaglio specifici dei tessuti delle associazioni GWAS. Javierre et al. hanno generato dati di cattura del promotore Hi-C in 17 tipi di cellule primarie del sangue umano e hanno identificato 2604 geni potenzialmente causali per i disturbi del sistema immunitario e del sangue, compresi molti geni con ruoli non previsti in queste malattie(Javierre et al., 2016). Allo stesso modo, Mumbach et al. hanno interrogato i GWAS SNPs associati a malattie autoimmuni utilizzando HiChIP dove hanno identificato ~10.000 interazioni promotore-alimentatore che collegavano diverse centinaia di SNPs ai geni bersaglio, la maggior parte dei quali non erano il gene più vicino (Mumbachet al., 2017). È importante notare che entrambi gli studi hanno riportato la specificità del tipo di cellula delle interazioni tra geni target SNP e SNP.

Le malattie cardiovascolari, tra cui l’aritmia cardiaca, l’insufficienza cardiaca e l’infarto del miocardio, continuano ad essere la principale causa di morte in tutto il mondo. Oltre 50 GWAS sono stati condotti solo per questi specifici fenotipi cardiovascolari, con più di 500 loci implicati nel rischio di malattie cardiovascolari (catalogo NHGRI GWAS, https://www.ebi.ac.uk/gwas/), la maggior parte dei quali mappano le regioni genomiche non codificanti. Per iniziare a sezionare i meccanismi molecolari con cui le varianti genetiche contribuiscono al rischio di CVD, è necessaria una mappa completa di regolazione genica delle cellule cardiache umane. Qui, vi presentiamo le mappe ad alta risoluzione di interazione del promotore ad alta risoluzione di iPSC umani e cardiomiociti derivati da iPSC (CMs). Utilizzando PCHi-C, abbiamo identificato centinaia di migliaia di interazioni del promotore in ogni tipo di cellula. Dimostriamo la rilevanza fisiologica di questi set di dati interrogando funzionalmente la relazione tra l’espressione genica e le interazioni a lungo raggio del promotore, e dimostriamo l’utilità dei dati di interazione a lungo raggio della cromatina per risolvere i target funzionali dei loci associati alla malattia.

Risultati

I cardiomiociti derivati dall’iPSC forniscono un modello efficace per studiare l’architettura della genetica CVD

Abbiamo usato le CMs derivate da iPSC(Burridge et al., 2014) come modello per studiare la regolazione genica cardiovascolare e la genetica delle malattie. I CMs generati in questo studio erano puri all’86-94% sulla base dell’espressione della proteina T della troponina cardiaca ed esibivano un battito spontaneo e uniforme (Figura 1-figure supplement 1A, Video 1) . Per dimostrare che iPSC e CMs ricapitolare i profili trascrizionali ed epigenetici di cellule primarie abbinate, abbiamo condotto RNA-seq e ChIP-seq per il marchio attivo enhancer H3K27ac in entrambi i tipi di cellule e confrontato questi dati con i tipi di cellule simili dal progetto Epigenome Roadmap Project(Kundaje et al., 2015). RNA-seq profili di iPSCs clusterizzati strettamente con cellule staminali embrionali H1, mentre CMs clusterizzati con entrambi i ventricolo sinistro (LV) e il cuore fetale (FH) profili(Figura 1-figure supplement 1B). Inoltre, abbiamo osservato che i tipi di cellule abbinate hanno mostrato una sovrapposizione tre volte maggiore nel numero di promotori-distale H3K27ac ChIP-seq picchi rispetto ai tipi di cellule non abbinate(Figura 1-figure supplement 1C,D), indicando che sia iPSC e CMs ricapitolare gli stati epigenetici specifici dei tessuti delle cellule staminali umane e cardiomiociti primari, rispettivamente.

Per convalidare ulteriormente il nostro sistema, abbiamo analizzato i geni espressi in modo differenziato tra iPSC e CMs. Tra il top 10% dei geni sovra-espressi nelle CMs erano geni direttamente correlati alla funzione cardiaca, compresi i fattori essenziali di trascrizione cardiaca(GATA4, MEIS1, TBX5 e TBX20) e prodotti di differenziazione(TNNT2, MYH7B, MYL7, ACTN2, NPPA, HCN4 e RYR2) (fold-change >1.5,_Padj<0,05, Figura 1-figure supplement 2A-C). Gene Ontologia (GO) l’analisi di arricchimento per i geni sovra-espressi in CMs rispetto a iPSCs ulteriormente confermato i fenotipi cardiaci specifici di queste cellule con termini top relativi allo sviluppo del sistema di conduzione cardiaca e la contrazione delle cellule del muscolo cardiaco(Figura 1-figure supplement 2D).

Promoter-capture Hi-C identifica gli elementi regolatori distali in iPSC e CMs

Per mappare in modo completo gli elementi regolatori a lungo raggio in iPSC e CM, abbiamo eseguito Hi-C in situ(Rao et al., 2014) in triplice differenziazione iPSC-CM; soprattutto, abbiamo usato l’enzima di restrizione MboI a quattro taglienti che genera frammenti di legatura con una dimensione media di 422 bp, consentendo una risoluzione a livello di potenziatore dei contatti del promotore. Abbiamo arricchito le librerie iPSC e CM in situ Hi-C per le interazioni del promotore attraverso l’ibridazione con un set di 77.476 sonde di RNA biotinilato (“esche”) che mirano a 22.600 promotori umani RefSeq protein-coding (vedi Materiali e metodi) e sequenziato ogni libreria ad una profondità media di ~ 413 milioni (M) paired-end leggi. Dopo aver rimosso i duplicati e le coppie di lettura che non hanno mappato su un’esca, abbiamo ottenuto una media di 31M e 41M coppie di lettura per ogni replicato per iPSC e CM, rispettivamente. Abbiamo usato CHiCAGO(Cairns et al., 2016), una pipeline di calcolo che tiene conto dei bias dalla cattura della sequenza, per identificare le interazioni significative e ulteriormente filtrate per quelle significative in almeno due dei tre replicati (vedi Materiali e metodi). Infine, ci siamo concentrati esclusivamente sulle interazioni che sono state separate da una distanza di almeno 10 kb. Questo criterio affronta l’alta frequenza di evet di legatura di prossimità nei dati Hi-C, che sono difficili da distinguere come contatti browniani casuali o interazioni funzionali della cromatina(Cairns et al., 2016). In totale, abbiamo identificato 350.062 interazioni del promotore in iPSC e 401.098 in CM. Una grande proporzione (~ 55%) delle interazioni sono state condivise tra i due tipi di cellule, indicando che anche ad alta risoluzione molte interazioni a lungo raggio sono stabili tra i tipi di cellule(Figura 1A). Circa il 20% di tutte le interazioni sono state tra due promotori, dimostrando l’elevata connettività tra i geni e sostenendo il ruolo recentemente suggerito dei promotori che agiscono come input di regolamentazione per i geni distali(Dao et al., 2017; Diao et al., 2017)(Figura 1B). La maggior parte delle interazioni sono state promotore-distale, con una mediana di ~170 kb tra il promotore e la regione distale che interagisce (Figura 1C).

Per confrontare le mappe PCHi-C con le caratteristiche note dell’organizzazione del genoma, abbiamo sequenziato le nostre librerie Hi-C di pre-cattura ad una profondità media di 665M di lettura per tipo di cellula e abbiamo identificato i domini topologicamente associati (TAD) con TopDom (vedi Materiali e metodi). I TAD sono unità organizzative di cromosomi definiti da blocchi genomici <1 megabase (Mb) che mostrano alte frequenze autointerattive con una frequenza di interazione molto bassa attraverso i confini del TAD (Dixon etal., 2012; Nora et al., 2012). In particolare, si ritiene che questa organizzazione vincoli l’attività degli elementi di regolazione cis per indirizzare i geni all’interno dello stesso TAD, poiché è stato dimostrato che l’interruzione dei confini del TAD porta all’attivazione aberrante dei geni nei TAD vicini(Nora et al., 2012; Lupiáñez et al., 2015; Franke et al., 2016; Symmons et al., 2016; Tsujimura et al., 2015 ). Abbiamo trovato che la maggior parte delle interazioni PCHi-C si è verificata all’interno di TAD (73 e 77% in iPSC e CM, rispettivamente; Figura 1D e Figura 1-figure supplement 3A). Le interazioni TAD-crossing (“inter-TAD”) contenevano proporzionalmente più interazioni promotore-promotori rispetto alle interazioni intra-TAD, ed erano più suscettibili di sovrapporsi ai siti CTCF distali promotore-distali; tuttavia, erano analogamente arricchite per il looping ai siti distali H3K27ac, un marchio di cromatina attiva (Figura 1-figuresupplement 3B-D). Le interazioni inter-TAD avevano punteggi CHiCAGO leggermente più bassi, che riflettono un numero inferiore di letture a supporto di queste interazioni, e si estendevano a distanze genomiche maggiori rispetto alle interazioni intra-TAD(Figura 1-figure supplement 3E,F). Inoltre, i promotori con interazioni inter-TAD erano preferibilmente localizzati vicino ai confini del TAD(Figura 1-figure supplement 3G) e avevano livelli di espressione più elevati rispetto ai promotori con interazioni intra-TAD, in particolare nei CM (Figura 1-figure supplement 3H). Queste osservazioni sono coerenti con studi precedenti che hanno dimostrato che i geni altamente espressi, in particolare i geni domestici, sono arricchiti ai confini del TAD(Dixon et al., 2012).

Per illustrare l’utilità delle mappe di interazione PCHi-C ad alta risoluzione, si evidenzia il locus GATA4 nella Figura 1D e E. GATA4 è un regolatore principale dello sviluppo del cuore(Watt et al., 2004; Pikkarainen et al., 2004) e il gene GATA4 si trova in una struttura TAD che è relativamente stabile tra iPSC e CM(Figura 1D). Tuttavia, PCHi-C ha identificato un aumento delle frequenze di interazione tra il promotore GATA4 e diverse regioni contrassegnate da H3K27ac, tra cui quattro stimolatori cardiaci in vivo convalidati dal browser Vista enhancer(Visel et al., 2007), in particolare in CMs e in coincidenza con una forte up-regolazione di GATA4(Figura 1-figure supplement 2C). Anche se le analisi basate su TAD aiutano a definire il panorama normativo cis di un gene, i dati ad alta risoluzione dell’interazione del promotore forniscono la risoluzione necessaria per mappare con precisione le interazioni tra il promotore e l’evidenziatore nel contesto della differenziazione cellulare.

Per convalidare la mappa di interazione CM come risorsa per la genetica delle malattie cardiovascolari abbiamo poi ampiamente caratterizzato diversi aspetti importanti dell’architettura genetica in CMs. Abbiamo confrontato le CM con le iPSC in ogni analisi come misura della specificità del tipo di cellula. Queste analisi servono come parametri di riferimento che si basano su caratteristiche consolidate dell’organizzazione del genoma e aiutano le interpretazioni dei ruoli che le interazioni a lungo raggio svolgono nella regolazione dei geni.

Le interazioni del promotore sono arricchite per motivi di fattori di trascrizione specifici dei tessuti

Gli stimolatori distali attivano i geni target attraverso il DNA looping, un meccanismo che permette ai fattori di trascrizione legati a distanza di entrare in contatto con il macchinario di trascrizione dei promotori target(Pennacchio et al., 2013; Miele e Dekker, 2008; Deng et al., 2012). Per valutare se questa caratteristica della regolazione genica si è riflessa nelle interazioni iPSC e CM, abbiamo condotto un’analisi dei motivi utilizzando HOMER(Heinz et al., 2010) sull’insieme delle sequenze di interazione promotore-distale in ogni tipo di cellula. Inizialmente ci siamo concentrati sulle interazioni per i geni espressi in modo differenziato tra iPSC e CM (fold-change >1.5, Padj <0 ._05). Abbiamo identificato CTCF come il motivo più arricchito in ogni caso(Figura 2A,B), coerente con il ruolo noto di questo fattore nel mediare le interazioni genomiche a lungo raggio a lungo raggio(Phillips and Corces, 2009; Phillips-Cremins et al., 2013; Nora et al ., 2017). Tra gli altri motivi top, abbiamo identificato i motivi del fattore di pluripotenza OCT4-SOX2-TCF-NANOG (OSN) e SOX2 come preferenzialmente arricchiti in sequenze distali in looping ai geni sovraespressi in iPSC(Figura 2A,C), mentre i motivi top in sequenze distali in looping ai geni sovraespressi in CMs incluso TBX20, ESRRB e MEIS1(Figura 2B,C). I fattori di trascrizione TBX20 e MEIS1 sono importanti regolatori dello sviluppo e della funzione del cuore(Cai et al., 2005; Sakabe et al., 2012; Mahmoud et al., 2013) e l’ESRRB è stato precedentemente identificato come un potenziale partner vincolante del TBX20 nei cardiomiociti dei topi adulti(Shen et al., 2011). Abbiamo anche osservato che le interazioni distali uniche per iPSC o CM sono state arricchite in modo simile per motivi di fattori di trascrizione specifici dei tessuti(Figura 2D). In linea con un recente rapporto che AP-1 contribuisce alla formazione di loop dinamici durante lo sviluppo dei macrofagi(Phanstiel et al., 2017), sia le interazioni iPSC e CM-specifiche sono stati arricchiti per motivi AP-1(Figura 2D), suggerendo che i fattori di trascrizione AP-1 può rappresentare un complesso organizzatore del genoma precedentemente non riconosciuto.

Le interazioni a lungo raggio del promotore sono arricchite per gli elementi cis-regolatori attivi e corrispondono alle dinamiche di espressione genica

Gli elementi regolatori cis funzionalmente attivi sono caratterizzati dalla presenza di specifiche modificazioni dell’istone; gli esaltatori attivi sono generalmente associati a H3K4me1 e H3K27ac(Creyghton et al., 2010; Heintzman et al., 2009), mentre gli elementi inattivi (ad es. in bilico o silenziati) sono spesso associati a H3K27me3(Rada-Iglesias et al., 2011; Erceg et al., 2017). A sostegno della funzione di regolazione genica delle interazioni a lungo raggio, abbiamo trovato che i frammenti MboI promotori-distali coinvolti nelle interazioni significative del promotore sono stati arricchiti per queste tre modifiche degli istoni sia in iPSCs che in CMs(Figura 3A-C). Quando i promotori sono stati raggruppati per livello di espressione, abbiamo osservato che questo arricchimento è aumentato con l’aumento di espressione per H3K27ac e H3K4me1, e diminuito con l’aumento di espressione per H3K27me3, coerente con una natura additiva di enhancer-promoter interazioni(Schoenfelder et al., 2015; Javierre et al., 2016), e convalidando che PCHi-C arricchisce per i probabili contatti funzionali a lungo raggio cromatina.

Una forte correlazione (coefficiente di correlazione di Pearson r> 0,7) tra il grado di modificazione degli istoni e l’espressione genica è stata segnalata per la prima volta quasi 10 anni fa (Karlić et al., 2010); tuttavia, tale analisi ha considerato solo le modificazioni degli istoni entro 2 kb di promotori. Per capire se questa relazione si estende oltre le regioni prossimali del promotore, abbiamo correlato il numero di picchi di ChIP-seq dell’istone entro 300 kb di promotori con il livello di espressione del promotore (Figura 3-figure supplement 1A,B). H3K27ac e H3K4me1 entrambi correlati positivamente con il livello di espressione (Spearman ρ = 0,22 e 0,16, rispettivamente in iPSC e ρ = 0,23 e 0 ,24, rispettivamente in CMs, p<2.2-16^); al contrario, H3K27me3 è correlato negativamente con il livello di espressione in CMs (Spearman’s ρ = -0.20, p<2.2-16); tuttavia, questa^relazione non era presente in iPSCs (Spearman’s ρ = 0.02, p=0.06). Sebbene moderate, queste correlazioni potrebbero in parte spiegare perché i geni espressi più alti mostrano un arricchimento più forte per le interazioni del promotore che si sovrappongono ai picchi degli istoni quando si usa un modello di sfondo a livello genomico (vedi Materiali e metodi), e danno supporto all’idea che i geni attivi si trovano in ambienti genomici generalmente attivi(Stevens et al., 2017; Gilbert et al., 2004).

Abbiamo poi studiato la relazione tra le interazioni specifiche del tipo di cellula e l’arricchimento per i marchi CTCF specifici per i tessuti, H3K27ac, e H3K27me3, ipotizzando che le interazioni uniche per iPSC o CM sarebbero più arricchite per le caratteristiche della cromatina specifiche per i tessuti. Infatti, abbiamo osservato che le interazioni specifiche per tipo di cellula preferibilmente coinvolti picchi H3K27ac dal tipo di cellula corrispondente, e sono stati o non arricchito (iPSC) o impoverito (CM) per i marchi H3K27ac che erano specifici per il tipo di cellula non corrispondente(Figura 3E, pannello centrale). Tuttavia, l’arricchimento più forte è stato per le interazioni specifiche del tipo di cellula per sovrapporre le caratteristiche della cromatina che erano presenti in entrambi i tipi di cellule(Figura 3E). Inoltre, le interazioni che sono stati condivisi tra iPSC e CMs sono stati più arricchiti per le caratteristiche cromatina condivisa. Questi risultati suggeriscono che tutte le interazioni, sia condivise o uniche per un tipo di cellula, preferibilmente contattare le regioni regolatorie che sono attive in entrambi i tipi di cellule, mentre le interazioni specifiche del tipo di cellula non sono suscettibili di verificarsi in regioni specificamente contrassegnate nel tipo di cellula non corrispondente.

Un esempio di un gene che comprende queste osservazioni è il gene peptidico natriuretico atriale NPPA(Figura 3F) che è espresso specificamente nelle cellule dell’atrio cardiaco ed è upregolato in CMs(Figura 1-figure supplement 2C). NPPA fa numerose cellule di tipo specifico interazioni con una regione distale che è solo contrassegnato con cromatina attiva (H3K27ac e H3K4me1) in CMs, inoltre, la caratterizzazione funzionale ha dimostrato che questa regione corrisponde ad un enhancer in vivo che ricapitola l’espressione endogena di NPPA nel cuore in via di sviluppo (Viselet al., 2007). Presi nel loro insieme, questi risultati illuminano la complessa relazione tra le interazioni a lungo raggio del promotore e la regolazione del gene e forniscono la prova che l’architettura del promotore riflette l’espressione genica specifica del tipo di cellula.

I cambiamenti dinamici nella compartimentazione genomica coinvolgono un sottoinsieme di geni specifici del cuore

Come benchmark finale dei nostri set di dati, abbiamo analizzato le differenze su larga scala nell’organizzazione del genoma tra iPSC e CM. I primi studi Hi-C hanno rivelato che il genoma è organizzato in due grandi compartimenti, A e B, che corrispondono rispettivamente a regioni aperte e chiuse dei cromosomi(Lieberman-Aiden et al., 2009; Rao et al., 2014). Anche se la maggior parte dei compartimenti sono stabili tra i diversi tipi di cellule, alcuni compartimenti cambiano stato in modo specifico per il tipo di cellula che può riflettere importanti cambiamenti nella regolazione dei geni(Dixon et al., 2015). Per valutare se l’acquisizione di dati Hi-C, che è più conveniente in termini di costi per l’acquisizione di interazioni incentrate sul promotore, è in grado di identificare i compartimenti A/B, abbiamo confrontato i nostri dati di acquisizione Hi-C con le biblioteche Hi-C di pre-acquisizione a livello genomico. I compartimenti A/B identificati utilizzando HOMER(Heinz et al., 2010) erano notevolmente simili nei set di dati del genoma intero e PCHi-C (corrispondenza del 97%, Figura 4A, pannello superiore, e Figura 4-figure supplements 1 e 2), dimostrando che i dati PCHi-C contengono informazioni sufficienti per identificare le regioni del genoma ampiamente attive e inattive. Come esempio, si evidenzia una regione di 10 Mb sul cromosoma 4 contenente il locus del gene CAMK2D(Figura 4A). I compartimenti erano relativamente stabili in questa regione in iPSC e CMs; tuttavia, il gene CAMK2D stesso si trovava in un compartimento dinamico che passava da inattivo in iPSCs ad attivo in CMs. Corrispondentemente, questo gene è stato altamente upregulated durante la differenziazione a CMs(Figura 4A, inserto).

Abbiamo osservato questo effetto a livello globale, in quanto i geni situati nei compartimenti A sono stati espressi a livelli significativamente più elevati rispetto ai geni situati nei compartimenti B sia negli iPSC che nelle CM(Figura 4B). Inoltre, i geni che hanno scambiato i compartimenti A/B tra i tipi di cellule sono stati corrispondentemente regolati in alto o in basso(Figura 4C). L’analisi GO dei 1008 geni che sono passati dai compartimenti B a quelli A durante la differenziazione iPSC-CM ha rivelato un arricchimento per termini come “sviluppo del sistema cardiovascolare” e “contrazione cardiaca” (Figura 4D, file supplementare 5). È importante notare che questi geni sono stati identificati esclusivamente in base alla loro posizione in un compartimento genomico dinamico e non dai dati di espressione genica. Analisi GO per i geni che sono passati da compartimenti A a compartimenti B durante la differenziazione iPSC-CM relativi a processi non cardiaci, come lo sviluppo della pelle, la differenziazione delle cellule epiteliali e la determinazione del sesso(Figura 4-figure supplement 3, file supplementare 5 e 6). Questi dati mostrano che la PCHi-C ha catturato accuratamente le interazioni tissutali specifiche e indicano che la compartimentazione dei geni nelle regioni spazialmente regolate del nucleo può essere un meccanismo per garantire l’espressione genica tissutale specifica(Dixon et al., 2015). In sintesi, le nostre analisi hanno dimostrato che le interazioni del promotore CM ricapitolano le caratteristiche chiave della regolazione e della funzione dei geni cardiaci, convalidando la mappa CM come strumento importante per indagare la genetica CVD.

Le interazioni del promotore CM collegano i GWAS SNPs ai geni target

Un’applicazione particolarmente rilevante delle mappe di interazione del promotore ad alta risoluzione è quella di guidare gli studi post-GWAS identificando i geni target delle varianti associate alla malattia. Abbiamo utilizzato questo approccio per collegare i GWAS SNPs per diverse importanti malattie cardiovascolari al loro gene target (o ai loro geni target) utilizzando la mappa di interazione CM. Abbiamo compilato 524 SNPs di piombo dal database NHGRI(https://www.ebi.ac.uk/gwas/) per tre importanti classi di CVD: aritmie cardiache, insufficienza cardiaca e infarto del miocardio(Tabella 1, file supplementari 7 e 8). A causa dei modelli di disequilibrio di collegamento (LD), il vero SNP causale potrebbe essere qualsiasi SNP in LD elevato con la variante di piombo. Pertanto, abbiamo ampliato questo insieme di SNPs per includere tutte le varianti in alta LD (r2 >0,9, entro 50 kb di SNP di piombo), aumentando il numero di varianti putatilmente causali a 10.475 (di seguito chiamati SNPs di LD). Abbiamo scoperto che nel 1999 (19%) degli SNP LD si trovavano in frammenti MboI promotori-distali che interagivano con i promotori di 347 geni in CMs(file supplementare 8), di seguito denominati geni bersaglio. La maggior parte (89%) delle coppie di geni target LD SNP-target sono stati localizzati all’interno dello stesso TAD, con una distanza mediana di 185 kb tra ogni coppia di geni target SNP(Figura 5A). È importante notare che il 90,4% delle interazioni geniche SNP-target ha saltato almeno un promotore genico e il 42% degli SNP ha interagito con almeno due diversi promotori(Figura 5B).

Tabella 1.Riepilogo dei SNP e dei geni target caratterizzati in ogni classe di malattia.I valori di riepilogo per ogni gruppo di malattie sono rappresentati insieme al numero totale di GWAS, SNP e geni bersaglio (colonna “Combinato”). Gli SNP dei tag sono stati identificati dai GWAS pubblicati nel database NHGRI-EBI; gli SNP in LD sono il numero totale di SNP non promotori (compresi gli SNP dei tag) in LD (r2 > 0.9) con gli SNP dei tag in ogni gruppo di malattie; gli SNP in looping ai geni sono gli SNP in LD che sono in un’interazione promotore distale; i geni target sono tutti i geni con un’interazione a un SNP promotore-distale. Vedere il file supplementare 8 per un elenco completo di tutti i GWAS, le coordinate di ogni SNP e del gene target assegnato, il livello di espressione in iPSC e CM e il fenotipo knock-out del mouse, se disponibile.
	Aritmia	Infarto del miocardio	Insufficienza cardiaca	Combinato
Numero di studi	30	11	11	50
Tag SNPs	358	86	80	524
SNPs in LD	6555	1822	2098	10,475
SNPs in looping ai geni	1152	357	490	1999
Geni bersaglio	237	72	53	347

Per confermare che le interazioni CM PCHi-C collegavano gli SNP ai geni target rilevanti per il CVD, abbiamo eseguito un’analisi GO e abbiamo scoperto che i geni target erano altamente e specificamente arricchiti per i processi biologici legati alla funzione cardiaca, come la ripolarizzazione della membrana e la conduzione cardiaca(Figura 5C, pannello sinistro e file supplementare 5 e 6). Come controllo, abbiamo usato le interazioni iPSC per collegare gli stessi SNPs ai geni target e abbiamo osservato un insieme completamente diverso di processi biologici non correlati per questi geni(Figura 5C, pannello di destra). Per caratterizzare ulteriormente la rilevanza biologica dei geni target, abbiamo estratto i dati di knock-out del mouse dal database Mouse Genome Informatics (MGI)(Blake et al., 2017), che ha rivelato che un numero statisticamente significativo di geni target ha portato ad un fenotipo cardiovascolare quando è stato messo knock-out nel mouse (78 geni (22,4%), p=1 × 10-5,^Figura 5D) . Infine, abbiamo esaminato i dati quantitativi di espressione dei tratti loci (eQTL) del tessuto del ventricolo sinistro umano (LV) ottenuti nell’ambito del progetto Genotype-Tissue Expresion (GTEx)(Carithers et al., 2015) e abbiamo trovato che, del 1999 LD SNPs nelle interazioni, 410 (20,5%) corrispondevano a LV eQTLs; in confronto, solo il 12,2% del set completo di LD SNPs corrispondeva a LV eQTLs (p<0,00001, Figura 5E). Abbiamo poi valutato se gli eQTLs si collegano al loro gene associato. Per questa analisi, abbiamo considerato l’intero set di LV eQTLs, in quanto i 410 LD SNP eQTLs rappresentano una percentuale troppo piccola di una parte dell’intero set (<0,1% di tutti i LV eQTLs) per accertare pienamente la significatività. A livello genomico, i LV eQTL nelle interazioni promotore-distale erano significativamente più probabili di loop al loro gene associato rispetto a quanto previsto per caso (p<0,00001, Figura 5F, pannello sinistro). È importante notare che questo significato è diminuito quando i LV eQTLs sono stati analizzati con interazioni promoter iPSC (p=0,035, Figura 5F, pannello di destra). Presi nel loro insieme, questi risultati indicano che le interazioni del promotore CM identificano un sottoinsieme di SNPs rilevanti per la malattia più probabilmente funzionali e supportano l’uso della mappa CM per assegnare SNPs distali associati a CVD ai geni target putativi.

Uso dell’espressione genica come metrica per l’interpretazione della rilevanza della malattia dei geni bersaglio appena identificati

Sulla base di un arricchimento dei geni target con funzione cardiaca nota, abbiamo poi valutato se il livello di espressione è una metrica informativa per dare ulteriore priorità agli studi di follow-up funzionale. Abbiamo esaminato il livello di espressione dei 347 geni target e abbiamo trovato che erano moderatamente sovra-espressi nelle CM rispetto alle iPSC (mediana log2 fold change = 1,08, media log2 fold change = 1,44, valori medi TPM erano 40,6 nelle iPSC e 60,1 nelle CM, p = 0,12, Figura 6A e B). Anche se non significativo, questo risultato riflette l’arricchimento di geni noti legati al cuore che interagiscono con i loci CVD. Tuttavia, poiché un sottoinsieme di geni target è stato sovraespresso nelle iPSC rispetto alle CMs(Figura 6C), abbiamo previsto che il livello di espressione genica da solo potrebbe essere una metrica insufficiente per valutare la rilevanza dei geni target per la biologia CVD. Infatti, abbiamo scoperto che 21 dei 78 geni target (27%) che causano fenotipi cardiovascolari quando sono stati messi fuori uso nei topi erano sovraespressi nelle iPSC rispetto alle CMs(file supplementare 8). Questo risultato indica che i geni putativi causali possono non apparire come candidati ovvi sulla base dei soli dati di espressione genica.

Per illustrare questo punto, si evidenziano due geni: TBX5, un gene direttamente collegato all’aritmia cardiaca(Figura 6D)(Smemo et al., 2012; Arnolds et al., 2012), e LITAF, un gene che, fino a poco tempo fa, non aveva un ruolo evidente nella biologia cardiaca(Moshal et al., 2017)(Figura 6E). Entrambi i geni formavano interazioni a lungo raggio a LD SNPs identificati in aritmia GWAS, rendendo entrambi i geni candidati bersagli funzionali delle associazioni GWAS. TBX5, che è sovra-espresso in CMs(Figura 6C), è il gene target più probabile dei SNPs LD nelle vicinanze sulla base dei dati di interazione, ma anche a causa del suo ruolo noto nel dirigere il corretto sviluppo del sistema di conduzione cardiaca. LITAF, d’altra parte, è stato sovraespresso in iPSCs rispetto alle CMs(Figura 6C) e non era noto per contribuire alla funzione cardiaca fino a quando un recente studio ha identificato questo gene come regolatore dell’eccitazione cardiaca nei cuori dei pesci zebra(Moshal et al., 2017).

Le interazioni del promotore CM sono informative per le associazioni cardiovascolari che non coinvolgono direttamente i cardiomiociti

Poiché le tre classi di malattia che abbiamo analizzato rappresentano diverse patologie, abbiamo previsto che i geni bersaglio identificati per ogni classe individualmente possono riferirsi a diversi processi biologici. In particolare, abbiamo considerato che le aritmie cardiache – che derivano direttamente da difetti nei cardiomiociti specializzati per la conduzione elettrica – possono scoprire i geni target più rilevanti per il cuore rispetto all’insufficienza cardiaca e all’infarto del miocardio, due CVD che coinvolgono anche sistemi non cardiaci. Se suddiviso nelle rispettive classi di malattia, abbiamo confermato che la maggior parte dell’arricchimento del GO per i termini cardiaci era guidato dall’aritmia cardiaca SNPs(Figura 7A), con termini direttamente correlati al sistema di conduzione cardiaca. Le analisi dell’infarto miocardico(Figura 7B) e dell’insufficienza cardiaca(Figura 7C) hanno evidenziato un insieme di geni che sono stati leggermente arricchiti per la regolazione della crescita e della morfogenesi, rispettivamente.

Nonostante questi processi apparentemente non specifici, ogni set di geni target conteneva importanti candidati rilevanti per la malattia. Ad esempio, una delle associazioni più forti per l’infarto del miocardio si trova tra i geni CELSR2 e PSRC1 sul cromosoma 1p13, ma uno schermo attento di geni la cui espressione è stata influenzata dall’allele di rischio implicava il gene SORT1 più distale(Musunuru et al., 2010). SORT1 codifica un recettore di ordinamento che si esprime in molti tessuti e che ha dimostrato di agire nel fegato per regolare i livelli di colesterolo(Petersen et al., 1997; Musunuru et al., 2010). Nonostante il funzionamento nel fegato, abbiamo identificato interazioni multiple del promotore tra SORT1 e il locus GWAS dell’infarto miocardico nelle CMs(Figura 7D), implicando direttamente SORT1 come gene target e dando ulteriore supporto alla validazione sperimentale di questo locus come potenziatore SORT1(Musunuru et al., 2010). Inoltre, il gene ACTA2 si trova a 220 kb di distanza dal locus GWAS per l’insufficienza cardiaca prossimale ai geni CH25H e LIPA sul cromosoma 10q21(Smith et al., 2010)(Figura 7E). ACTA2 codifica la proteina dell’actina specifica delle cellule muscolari lisce e le mutazioni di questo gene hanno dimostrato di causare, tra le altre malattie vascolari, una malattia coronarica(Guo et al., 2009). Nonostante la sua posizione ad una notevole distanza dall’associazione GWAS, le interazioni della cromatina forniscono un importante livello di evidenza che ACTA2 è un gene causale putativo nello sviluppo dello scompenso cardiaco. Pertanto, la mappa di interazione CM non è solo utile per interrogare malattie direttamente correlate ai cardiomiociti, come nel caso delle aritmie cardiache, ma aiuta anche l’interpretazione dei geni target che possono agire nei tessuti non cardiaci.

Discussione

La comprensione incompleta della regolazione dei geni a lungo raggio è un ostacolo importante nella traduzione dei loci associati al GWAS in biologia della malattia. Le sfide principali in questo processo includono l’identificazione di una presunta mappatura delle varianti causali all’interno degli elementi regolatori e il collegamento funzionale di questi elementi regolatori ai loro geni bersaglio. Per delineare le interazioni gene-regolamentazione tra SNPs associati a CVD e geni causali presunti, abbiamo generato mappe ad alta risoluzione delle interazioni del promotore nelle iPSC umane e nelle CM derivate da iPSC. Abbiamo dimostrato che i promotori interagiscono con un insieme diversificato di elementi del DNA distale in entrambi i tipi di cellule, comprese le sequenze di promotori noti, che riflettono l’identità delle cellule e corrispondono all’espressione genica specifica del tessuto. Per dimostrare l’utilità della mappa CM, abbiamo collegato 1.999 SNPs associati CVD a geni bersaglio causali presunti che hanno identificato sia i geni convalidati e potenzialmente nuovi importanti per la biologia delle malattie cardiovascolari. Per convalidare la rilevanza biologica delle nostre mappe, abbiamo affrontato diverse caratteristiche importanti delle interazioni a lungo raggio cromatina nelle analisi comparative.

I promotori contattano le regioni distali arricchite per motivi di fattori di trascrizione specifici dei tessuti

La regolazione dei geni mediante elementi regolatori a distanza comporta il collegamento di sequenze di DNA separate linearmente, ad esempio tra un promotore e i suoi stimolatori distali, attraverso meccanismi di looping della cromatina(Spitz e Furlong, 2012). A sostegno di questo modello, riportiamo un arricchimento dei motivi dei fattori di trascrizione che definiscono i tessuti nelle sequenze che interagiscono distalmente di promotori espressi in modo differenziato sia per le CM e le iPSC, fornendo un importante livello di evidenza per convalidare la rilevanza funzionale delle interazioni iPSC e CM. Una spiegazione di questo arricchimento è che le nostre mappe di interazione sono ad alta risoluzione. Abbiamo generato librerie Hi-C con il cutter MboI da 4 bp, che genera frammenti con una dimensione media di 422 bp; questa maggiore specificità della regione catturata porta probabilmente ad una migliore risoluzione della sottostante sequenza di enhancer e, di conseguenza, ad una maggiore potenza per rilevare brevi motivi di legame del fattore di trascrizione.

Influenza delle interazioni attive e repressive del promotore a livello di espressione genica

La maggior parte degli studi di cattura Hi-C finora hanno riportato che il livello di espressione genica è correlato con l’arricchimento di vari segni istonici. Abbiamo osservato la stessa tendenza nei nostri dati, con geni altamente espressi che mostrano un forte arricchimento per il looping nelle regioni distali marcate H3K4me1 e H3K27ac, e geni poco espressi che mostrano un forte arricchimento per il looping nelle regioni marcate H3K27me3. Questi dati sono coerenti con un modello in cui il numero di interazioni a lungo raggio con gli stimolatori o i repressori contribuisce ulteriormente al livello di espressione genica(Schoenfelder et al., 2015; Javierre et al., 2016). Le forze che guidano una maggiore associazione tra promotori ed elementi regolatori cis distali non sono completamente comprese e sono state oggetto di indagine nel campo dell’organizzazione del genoma e della biologia della cromatina per diversi anni(Dekker e Mirny, 2016; Calo e Wysocka, 2013). Una possibilità è che questo arricchimento crescente sia guidato dalla compartimentazione genomica della cromatina attiva e inattiva. Abbiamo dimostrato che il livello di espressione di un gene è correlato al numero di picchi di ChIP-seq dell’istone all’interno di una grande finestra (300 kb) che circonda ogni promotore. Così, i geni altamente espressi sono più propensi a contattare le regioni di cromatina attiva rispetto ai geni poco espressi, che corrispondono all’arricchimento crescente osservato dei contatti e dell’espressione che noi e altri abbiamo riportato. Questo aumento locale della cromatina attiva o repressiva può essere una delle forze trainanti alla base dell’aumento del livello di espressione dipendente dall’associazione tra i promotori e gli elementi regolatori cis, simile ad un modello di separazione di fase mediato da un modello di interazioni tra promotori e promotori(Hnisz et al., 2017).

Una mappa di interazione del promotore per la genetica delle malattie cardiovascolari

Abbiamo dimostrato diversi modi in cui i dati di interazione del promotore possono essere utilizzati per comprendere meglio la genetica delle malattie, affrontando in particolare il requisito principale per una mappa ad alta risoluzione della rete di regolazione genica nei cardiomiociti umani. Sebbene le CMs derivate da iPSC siano note per essere relativamente immature e non riflettano pienamente i diversi aspetti strutturali e funzionali delle cellule cardiache adulte(Gherghiceanu et al., 2011; Karakikes et al., 2015), la difficoltà di ottenere sottopopolazioni pure di cardiomiociti primari ad alta integrità richiede l’uso di un sistema in vitro. Abbiamo dimostrato che le CM usate in questo studio erano altamente pure e ricapitolano le proprietà di regolazione genica note dei cardiomiociti primari. Grazie a questa purezza, siamo stati in grado di integrare SNPs associati a CVD con interazioni del promotore CM con alta fiducia, assegnando quasi il 20% delle varianti in alta LD con queste associazioni a 347 geni target.

Sostenendo la rilevanza fisiologica delle CMs al sistema di conduzione cardiaca, abbiamo trovato che i geni target erano più rilevanti per i loci GWAS associati alle aritmie cardiache, in linea con le precedenti scoperte nelle cellule immunitarie che molte interazioni dei geni target erano uniche per i sottotipi di cellule immunitarie rilevanti(Javierre et al ., 2016; Mumbach et al., 2017). I nostri dati hanno anche rivelato che anche per le malattie la cui eziologia coinvolge tipi di cellule diverse dai cardiomiociti, come l’infarto del miocardio e l’insufficienza cardiaca, abbiamo identificato interazioni che coinvolgono loci associati a queste malattie che ricapitolano le interazioni stimolatore-promotori in tipi di cellule non cardiache. Come esempio, abbiamo dimostrato che un locus convalidato di infarto miocardico interagisce con il promotore distale SORT1 nelle CM anche se questo locus è stato ampiamente caratterizzato nel contesto del metabolismo del colesterolo negli epatociti. Pertanto, le interazioni del promotore che osserviamo collegando il locus di malattia al SORT1 possono rappresentare un’architettura genomica invariante dei tessuti, che riflette probabilmente l’organizzazione del genoma in generale è relativamente stabile(Dixon et al., 2015; Jin et al., 2013; Ghavi-Helm et al., 2014). Mentre sosteniamo l’uso della mappa CM per lo studio dei meccanismi di regolazione genica delle malattie legate alla biologia dei cardiomiociti, sottolineiamo anche che, laddove identificata, qualsiasi interazione tra un promotore e una regione genomica associata a una malattia putativa serve come un importante livello di evidenza per dare priorità a quel gene per i futuri studi di follow-up.

Limitazioni delle mappe PCHi-C

La tecnica PCHi-C promette di identificare ad alta risoluzione e di produrre tutti gli elementi di regolazione genica in qualsiasi tessuto o stadio di sviluppo di interesse. Tuttavia, a causa di limitazioni tecniche e biologiche, ci sono importanti avvertimenti alla PCHi-C che dovrebbero essere presi in considerazione quando si interpretano i dati di interazione iPSC o CM. L’avvertenza più importante è che ci sono probabilmente molti falsi negativi, o interazioni “mancanti”. Anche se la fase di cattura arricchisce notevolmente per il promotore contenente frammenti di legatura in una biblioteca Hi-C, il panorama totale dei contatti del promotore in una popolazione di cellule è ancora sottocampionata, anche con una profondità di sequenziamento di ~ 400M legge per ogni replicato condotto per questo studio. Ciò è dovuto a diversi fattori, tra cui l’efficienza di ibridazione di ogni esca, la capacità di progettare un numero sufficiente di esche per promotore e la natura transitoria di molte interazioni normative. Quest’ultimo aspetto è confuso dall’effetto dipendente dalla distanza sulla frequenza di legatura: all’aumentare della distanza tra due frammenti, aumenta anche la profondità di lettura necessaria per identificare in modo robusto tale interazione. La fattibilità di sequenziamenti più profondi e di modifiche alle condutture computazionali continuerà a migliorare la copertura e la risoluzione dei dati Hi-C.

Inoltre, poiché il programma CHiCAGO non incorpora i confini del TAD nel suo modello di sfondo, potrebbe sottovalutare leggermente il numero previsto di letture corrispondenti alle interazioni intra-TAD che potrebbero portare a potenziali falsi positivi. Tuttavia, notiamo che esiste una forte corrispondenza tra le TAD chiamate su dati Hi-C pre-catturati e le interazioni PCHi-C identificate con CHiCAGO(Figura 1-figure supplement 3A); questo suggerisce che la contabilizzazione dei confini TAD può migliorare solo marginalmente la nostra capacità di identificare le interazioni significative.

Una considerazione finale è l’interpretazione delle interazioni che coinvolgono i geni inattivi. Anche se la maggior parte degli elementi normativi sono considerati come attivanti, è possibile che le interazioni a lungo raggio possano anche contribuire al silenziamento genico; ciò è supportato dall’osservazione che i geni silenziosi sono arricchiti per le interazioni a lungo raggio fino alle regioni marcate H3K27me3(Figura 3D). In alternativa, i geni silenziosi possono entrare in contatto con elementi regolatori che non sono attivi nel tipo di cellula analizzata o nella fase di sviluppo; questi possono rappresentare loop ‘preformati’ tra i geni e i loro elementi regolatori, come descritto in Ghavi-Helm et al. (2014).

Nonostante queste limitazioni, i set di dati che forniamo qui rappresentano un insieme altamente arricchito di ~350.000 e ~400.000 interazioni del promotore in iPSC e CMs, rispettivamente; anche se ci sono probabilmente interazioni mancanti, le interazioni che abbiamo identificato devono essere considerate come molto alta fiducia, in quanto sono stati identificati indipendentemente in almeno due repliche biologiche e mostrano un forte segnale di arricchimento per le caratteristiche note dell’architettura del genoma e la regolazione del gene. In conclusione, le mappe di interazione del promotore che abbiamo generato in questo studio rappresentano risorse importanti per qualsiasi indagine sui meccanismi di regolazione genica alla base dei tratti delle malattie cardiovascolari. L’elenco delle varianti di regolazione dei candidati e dei loro geni bersaglio può servire come punto di ingresso per diverse ipotesi relative al GWAS CVD, e può essere prontamente testato in contesti sperimentali. Per fornire sia le mappe iPSC che le mappe CM come risorsa accessibile, abbiamo ospitato l’insieme completo dei dati presentati in questo studio come un hub di pista pubblico presso il WashU EpiGenome Browser(Zhou et al., 2015), accessibile al seguente link: http://epigenomegateway.wustl.edu/browser/?genome=hg19&publichub=Lindsey. Inoltre, forniamo i significativi file di interazione PCHi-C utilizzati in tutte le analisi del materiale supplementare(file supplementari 1 e 2); questi possono essere applicati alle future analisi multiomiche della regolazione genica e della genetica delle malattie.

Materiali e metodi

Tabella delle risorse chiave.
Tipo di reagente (specie) o risorsa	Designazione	Fonte o riferimento	Identificatori	Ulteriori informazioni
Linea cellulare(H. sapiens, maschio)	H19101 iPSC	10.1101/gr.224436.117
Anticorpo	Anti-acetilico Histone H3 (Lys27) (monoclonale del mouse)	Wako Chemicals (USA)	306–34849	H3K27ac ChIP-seq
Anticorpo	Troponina T anticardiaca (monoclonale del topo)	BD Bioscienze	564767	Citometria a flusso CM
Composto chimico, farmaco	ROCK Y-27632 diidrocloruro	Abcam	ab120129, 10 mg	Cultura tissutale iPSC
Composto chimico, farmaco	CHIR-99021 triidrocloruro	Tocris	4953	Differenziazione CM
Composto chimico, farmaco	Wnt-C59	Tocris	5148	Differenziazione CM
Saggio commerciale o kit	TruSeq RNA libarary prep kit V2	Illumina	RS-122-2001	RNA-seq
Saggio commerciale o kit	NEBNext Multiplex Oligos per Illumina	NEB	E7335S	Ciao-C
Saggio commerciale o kit	Kit di trascrizione MEGAshortscript T7	Thermo Fisher	AM135	Generazione di sonde
Reagente a base di sequenza	Primer A	IDT	5′-CTGGGAATCGGAATCGCACCCCCCCGTGTGT-3′	Generazione di sonde
Reagente a base di sequenza	Primer B	IDT	5′-CGTATGAGGATGAGCCGGCCAGTG-3′	Generazione di sonde
Reagente a base di sequenza	Primer A T7	IDT	5′-GGATTCTAATACATACGACTCACT ATAGGGATCGATCGCACCCACCCCCCGTGTGT-3′.	Generazione di sonde
Reagente a base di sequenza	primer di bloccaggio P5	IDT	1016184	Cattura Hi-C
Reagente a base di sequenza	primer di bloccaggio P7	IDT	1016186	Cattura Hi-C

Cultura tissutale degli iPSC

Abbiamo utilizzato la linea iPSC Yoruban iPSC 19101, gentilmente fornita dal laboratorio di Yoav Gilad. Questa linea iPSC è stato riprogrammato da cellule linfoblastoidi come parte di un precedente studio, dove è stato dimostrato di differenziare in tutti e tre gli strati di germe, ha mostrato un cariotipo normale, ed espresso marcatori caratteristici di pluripotenza(Banovich et al., 2018). iPSCs sono stati coltivati in Essential 8 (E8) Medium (Thermo Fisher #A1517001) integrato con 1X Penicillin-Streptomicina (Pen/Strep, Gibco) su Matrigel rivestiti piatti di coltura dei tessuti (Corning #354277). Le cellule sono state passate quando erano ~ 80% confluenti con soluzione di dissociazione senza enzimi (30 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1X PBS meno magnesio e calcio) e mantenuto in E8 Medium con 10 μM Y-27632 diidrocloruro (Abcam #ab120129) per 24 ore. Medium è stato sostituito ogni giorno. colture iPSC regolarmente testato negativo per la contaminazione da micoplasma utilizzando il kit universale di rilevamento del micoplasma (ATCC # 30-1012K).

Differenziazione dei cardiomiociti

Le differenziazioni dei cardiomiociti erano basate sul protocollo di Burridge et al. (2014) con le modifiche descritte in Banovich et al .(Banovich et al., 2018). Gli iPSC sono stati espansi in piatti da 60 mm in media E8 fino a raggiungere una confluenza del 60-70%, al momento in cui la differenziazione è stata avviata (giorno 0). Il giorno 0, E8 media è stato sostituito con 10 mL di media cardiaci di base/12 μM GSK-3 inibitore CHIR-99021 triidrocloruro (Tocris #4953)/Matrigel overlay [media cardiaci di base: RPMI 1640 meno L-glutammina (HyClone #SH30096.01) con 1X GlutaMax (Life Technologies #11879020) integrato con 1X B27 meno insulina (Thermo Fisher #A1895601) e 1X Pen/Strep; la sovrapposizione Matrigel è stata realizzata sciogliendo Matrigel in 50 mL di media cardiaca di base ad una concentrazione di 0,5X secondo il fattore di diluizione specifico del lotto]. Dopo 24 ore (giorno 1), l’inibitore GSK-3 è stato rimosso sostituendo la media con 10 mL di media cardiaca di base. Il giorno 3, la media è stata sostituita con 10 mL di media cardiaca di base integrata con 2 μM Wnt-C59 (Tocris #5148). Il 5° giorno (48 ore dopo), i media sono stati sostituiti con 10 ml di media cardiaci di base. Il giorno 7, le cellule sono state lavate una volta con 1X PBS e poi sono stati aggiunti 15 mL di media cardiaca di base. I supporti sono stati sostituiti ogni due giorni in questo modo fino al 15° giorno in cui sono stati selezionati i cardiomiociti sostituendo i supporti cardiaci di base con 10 mL di lattato (RPMI 1640 meno D-glucosio, più L-glutammina (Life Technologies #11879020), integrata con 0.5 mg/mL di albumina umana ricombinante (Sigma 70024-90-7), 5 mM di sodio DL-lattato (Sigma 72-17-3), 213 μg/mL di acido L-ascorbico 2-fosfato (Sigma 70024-90-7) e 1X Pen/Strep). Lattato media è stato sostituito ogni due giorni fino al giorno 20 a quel punto sono stati raccolti cardiomiociti. Le cellule provenienti da differenziazioni di successo hanno mostrato un battito spontaneo intorno ai giorni 7-10.

I cardiomiociti sono stati raccolti lavando una volta con 1X PBS seguito da incubazione in 4 mL TrypLE (Life Technologies 12604-021) a 37°C per 5 min. Dopo l’incubazione, 4 mL di lattato è stato aggiunto al TrypLE e una pipetta da 1 mL è stata utilizzata per dislocare le cellule. Le cellule sono state filtrate una volta con un filtro da 100 μM e poi una volta con un filtro da 40 μM. Le cellule sono state pellettate a 500xg e poi risospese in PBS e contate. Per ogni lotto di differenziazione, 5 milioni di cellule sono state prese per la cattura del promotore Hi-C e 1 milione di cellule sono state prese per l’RNA-seq. Per valutare la purezza, 2 milioni di cellule sono state prese per l’analisi citometrica a flusso utilizzando un anticorpo per la troponina T cardiaca (BD Biosciences 564767). Tutte le cellule utilizzate negli esperimenti a valle erano almeno l’86% di Troponina T positiva(Figura 1-figure supplement 1A). Abbiamo effettuato tre differenziazioni indipendenti della stessa linea iPSC e generato promotore-cattura Hi-C e RNA-seq librerie in iPSC e CM da ogni triplice copia.

Acquisizione del promotore Hi-C

Reticolazione delle celle

Gli iPSC o cardiomiociti sono stati raccolti da piatti per la coltura dei tessuti e contati. Le cellule sono state risospese in 1X PBS ad una concentrazione di 1 milione di cellule/mL e il 37% di formaldeide è stato aggiunto ad una concentrazione finale dell’1%. La reticolazione è stata effettuata per 10 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. La glicina è stata aggiunta ad una concentrazione finale di 0,2 M per estinguere la reazione. Le cellule sono state pellettate, congelate a scatto in azoto liquido e conservate a -80°C fino a quando non sono state pronte per la lavorazione Hi-C.

in situ Hi-C

Abbiamo preparato tutte le librerie di cattura Hi-C del promotore in un unico lotto utilizzando tre pellet reticolati di 5 milioni di cellule sia per iPSC che per i cardiomiociti derivati da iPSC, che rappresentano tre differenziazioni indipendenti di cardiomiociti. La fase Hi-C in situ è stata eseguita come in Rao et al. (2014) con una singola modifica in cui sono stati utilizzati i reagenti NEBNext del kit NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (NEB #E7335S) al posto degli adattatori Illumina, seguendo le istruzioni del produttore. Le librerie Hi-C sono state amplificate direttamente dalle perline T1 (Life Technologies #65602) utilizzando i primer NEBNext e sei cicli di PCR.

Cattura del promotore – progettazione e generazione della sonda

Le sonde di cattura Hi-C sono state progettate per mirare a quattro estremità di frammenti di restrizione MboI (120 bp) vicino al TSS dei geni RefSeq di codifica delle proteine(O’Leary et al., 2016) mappati a hg19 nel Genome Browser UCSC(Speir et al., 2016). Per selezionare i frammenti di restrizione, abbiamo mantenuto solo frammenti di restrizione MboI più lunghi di 200 bp e sovrapposti di 10 kb intorno a un RefSeq TSS. Per i TSS più vicini a 1 kb l’uno dall’altro, ne è stato mantenuto solo uno, in quanto le loro interazioni erano probabilmente catturate dagli altri TSS RefSeq. Le quattro estremità dei frammenti di restrizione MboI più vicine ad ogni RefSeq TSS sono state selezionate come sonde putativo. Le sequenze da 120 bp sono state sottoposte al software proprietario SureDesign di Agilent per la selezione delle sonde, che può spostare leggermente la posizione e rimuovere le sonde. In totale, abbiamo ordinato una libreria di 77.476 oligo-dna a filamento singolo da CustomArray, Inc.(www.customarrayinc.com). Ogni oligo consisteva della sequenza 5′-ATCGCGCACCAGGGTGTGTGTN120CACTGCGGGCTCCTCA-3′ (Gnirkeet al., 2009) dove N120 rappresenta i 120 nucleotidi adiacenti al sito di taglio MboI. L’elenco completo delle sonde oligo e il nome del gene corrispondente è fornito nel file supplementare 9.1.

Gli oligo sono arrivati come un pool contenente 1000 ng di materiale. Abbiamo usato 16 ng del pool di oligo in una reazione PCR per renderli a doppio filamento utilizzando primer 5′-CTGGGAATCGCCACCAGCGGTGTGT-3′ (Primer A), e 5′-CGTGGGATGAGGAGGAGGCCGCAGGTG-3′ (Primer B) come in (Gnirke et al.,2009). La reazione di PCR è stata pulita con perle AMPure XP (Agencourt #A6388) ed eluita con 20 μl di acqua. Per aggiungere il promotore T7 completo all’estremità 5′ degli oligo, è stata effettuata una seconda reazione di PCR utilizzando 10 ng del prodotto di PCR pulito di primo turno con il primer forward 5′-GGGATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGATCGCACCAGGGTGTGT-3′ (Primer A T7). Abbiamo purificato il prodotto di PCR corrispondente a 176 bp utilizzando un kit di estrazione del gel Qiagen (#28704). Per generare esche di RNA biotinilato, abbiamo eseguito la trascrizione in vitro sulla libreria a doppio filamento utilizzando il MEGAshortscript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher #AM135) con Biotin-16-dUTP (Sigma #11388908910). Dopo il trattamento DNase la reazione di trascrizione è stata pulita con il kit MEGAclear (Thermo Fisher #AM1908) ed eluita con 50 μl di tampone di eluizione. Abbiamo confermato la corretta dimensione dell’esca su un gel denaturante.

Cattura del promotore – ibridazione con la libreria Hi-C

Per isolare i frammenti contenenti frammenti del promotore dalla biblioteca Hi-C in situ dell’intero genoma, abbiamo ibridato la piscina di esche di RNA biotinilato con la biblioteca Hi-C come segue. Una miscela contenente 500 ng della biblioteca Hi-C, 2,5 microlitri di DNA Cot-1 umana (Invitrogen # 15279-011), 2,5 microlitri di DNA di sperma di salmone (Invitrogen # 15632-011), 0,5 microlitri di primer di blocco P5 (IDT #1016184), e 0,5 microlitri di primer di blocco P7 (IDT #1016186) è stato riscaldato per 5 min. a 95°, tenuto a 65° e miscelato con 13 μl di tampone di ibridazione preriscaldato (10X SSPE, 10X Denhardt’s, 10 mM EDTA e 0,2% SDS) e una miscela preriscaldata di 6 μl di 500 ng di esca RNA biotinilata e 20U SUPERase-In (Thermo Fisher #AM2694). La miscela di ibridazione è stata incubata per 24 ore a 65°C. Per isolare i frammenti catturati, abbiamo preparato 500 ng di perle magnetiche rivestite di streptavidina (Dynabeads MyOne Streptavidin T1, Thermo Fisher # 65601) in 200 μl di tampone legante (1M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA). La miscela di ibridazione è stata aggiunta alle perle di Streptavidina e ruotata per 30 minuti a temperatura ambiente. Le perle contenenti i frammenti di Hi-C catturati sono stati lavati con 1X SSC, 0,1% SDS per 15 min a temperatura ambiente, seguito da tre lavaggi (10 min ciascuno) a 65 ° C con 0,1X SSC / 0,1% SDS. Dopo il lavaggio finale, le perle sono state risospese in 22 μl di acqua e si è proceduto alla post-captazione PCR. La reazione PCR è stata eseguita come prima, con 11 μl di ‘cattura Hi-C perline’ e 8 cicli di amplificazione. Una purificazione delle perle AMPure XP è stata utilizzata per pulire la reazione PCR e il DNA è stato quantificato utilizzando il sistema QuantiFluor dsDNA System (Promega #E2670) e un bioanalizzatore ad alta sensibilità. Le librerie Hi-C di acquisizione finale sono state sottoposte a 100 bp di sequenziamento paired-end su una macchina Illumina HiSeq 4000. I riepiloghi del conteggio letti sono forniti nel file supplementare 9.2.

9.2. Interazione che chiama

Abbiamo usato HiCUP v0.5.9(Wingett et al., 2015) per allineare e filtrare le letture Hi-C (i conteggi delle letture totali e filtrate sono presentati nel file supplementare 9.2). Le letture uniche sono state date a CHiCAGO versione 1.2.0(Cairns et al., 2016) e sono state chiamate interazioni significative con parametri predefiniti. In questo studio ci siamo concentrati esclusivamente sulle interazioni cisin quanto l’evidenza che le interazioni transcromosomiche contribuiscono alla regolazione dell’espressione genica è limitata. CHiCAGO riporta le interazioni per ogni frammento di restrizione catturato; per riassumere le interazioni per gene, abbiamo considerato l’intervallo che abbraccia tutti i frammenti catturati (cioè l’insieme di sonde che abbracciano ogni TSS) come la regione promotrice (“TSS fusa”). Ciò significa che le regioni promotrici create hanno lunghezze variabili. Nei casi in cui più geni sono stati annotati nella stessa regione promotrice, riportiamo l’interazione per ogni gene individualmente. Questa annotazione ci ha permesso di eseguire analisi a livello genico, ad esempio in base al livello di espressione. Abbiamo eliminato questa ridondanza se necessario, ad esempio nelle analisi di arricchimento del motivo dei frammenti che interagiscono con il promotore. Usando i file di interazione “merged TSS”, abbiamo filtrato le interazioni per mantenere quelle mappate entro 1 kb l’una dall’altra in almeno due repliche. In particolare, abbiamo esteso ogni frammento di promotore-interazione di 1 kb per ogni estremità e poi abbiamo usato la funzionalità pairToPair di BEDTools(Quinlan e Hall, 2010) per identificare le interazioni in cui entrambe le estremità corrispondevano tra i replicati. Per identificare le interazioni specifiche del tipo di cella, abbiamo richiesto che l’interazione (con l’estensione di 1 kb) non fosse presente in nessuno dei tre replicati dell’altro tipo di cella. Il numero di coppie di lettura per promotore e il numero corrispondente di interazioni significative identificate è presentato nel file supplementare 9.3. Le analisi TAD, l’arricchimento del motivo, l’arricchimento del picco ChIP-seq e le analisi eQTL (relative alle Figure 1, 2, 3 e 5) sono state condotte con interazioni a livello di frammentazione (nessuna estensione 1 kb). Le analisi GWAS SNP sono state condotte con interazioni con estensione 1kb, in quanto si è cercato di essere il più inclusivi possibile nel collegare gli SNP CVD ai geni target.

Le interazioni PCHi-C, TAD, RNA-seq, ChIP-seq disponibili al pubblico, e GWAS SNPs sono ospitate dal WashU EpiGenome Browser(Zhou et al., 2015) come hub pubblico. È possibile accedere a questo sito web all’indirizzo http://epigenomegateway.wustl.edu/browser/. L’hub pubblico (“A promoter interaction map for cardiovascular disease genetics”) si trova sotto il browser Human Hg19.

Trame in stile 4C

Per generare i conteggi di lettura dei geni visualizzati nelle figure del navigatore genome-browser, tutte le coppie di lettura mappate per catturare i frammenti MboI per un determinato promotore sono state sommate attraverso i replicati. In particolare, abbiamo sommato le letture per ogni frammento MboI in cui la lettura era parte di una coppia di lettura che mappata ad un’esca per il gene dato. Gli archi che sono visualizzati sotto la trama in stile 4C rappresentano interazioni significative che sono state identificate in almeno due repliche come descritto sopra in ‘Interaction calling’.

Analisi TAD

Per identificare i TAD, abbiamo raggruppato le letture attraverso i replicati per ogni tipo di cella utilizzando i dati Hi-C di pre-acquisizione (600M letture per iPSC e 733M letture per CM) e utilizzato HiCUP v0.5.9(Wingett et al., 2015) per allineare e filtrare le letture Hi-C. HOMER v4.8.3(Heinz et al., 2010) è stato utilizzato per generare matrici di interazione normalizzate ad una risoluzione di 40 kb e poi TopDom v0.0.2(Shin et al., 2016) è stato utilizzato con una dimensione di finestra w = 10 per identificare domini topologici, confini e lacune. Abbiamo considerato solo i domini per le analisi di questo documento. Abbiamo considerato un’interazione di cattura del promotore Hi-C come ‘intra-TAD’ se l’intero arco dell’interazione era completamente contenuto in un singolo dominio. Le interazioni ‘Inter-TAD’ sono definite come interazioni in cui ogni estremità mappa un dominio diverso.

Scomparti A/B

Il programma runHiCpca.pl del pacchetto HOMER(Heinz et al., 2010) v4.8.3 è stato utilizzato per chiamare i compartimenti A/B con -res 50000 sia per il genoma intero che per l’acquisizione di dati Hi-C.

RNA-seq

L’RNA totale è stato estratto da pellet congelati in flash di 1 milione di cellule utilizzando TRI Reagent (Sigma #T9424) e un omogeneizzatore seguito dall’isolamento dell’RNA e dalla pulizia con il Direct-zol RNA Kit (Zymo Research #11-331). Le librerie di RNA-seq sono state generate con il kit Illumina TruSeq V2 (Illumina, RS-122-2001) e 1 μg di RNA, seguendo le istruzioni del produttore. Le librerie sono state realizzate con RNA isolato da tre differenziazioni indipendenti iPSC-CM (triplicati di iPSC e di cardiomiociti). Le librerie sono state sequenziate su un Illumina HiSeq 4000.

I conteggi dei geni sono stati quantificati con Salmon 0.7.2(Patro et al., 2017) e importati con tximport 1.2.0(Soneson et al., 2015) in DESeq2 1.12.4(Love et al., 2014) per chiamare i geni espressi differenzialmente. Per selezionare i geni espressi differenzialmente per le analisi a valle è stata richiesta una differenza minima di 1,5 volte tra CM e triplicati iPSC e un valore p minimo regolato di 0,05 per selezionare i geni espressi differenzialmente per le analisi a valle. TPMs (trascrizioni per milione) sono stati anche stimati da Salmon. Poiché i campioni chiaramente raggruppati in base ai loro tessuti noti di origine(Figura 1-figure supplement 2A), non è stata eseguita alcuna correzione per gli effetti del lotto.

H3K27ac ChIP-seq per il confronto con i campioni della tabella di marcia epigenoma

Abbiamo eseguito ChIP-seq su 2,5 milioni di cellule ciascuna per iPSC e CMs utilizzando anticorpi H3K27ac (Wako #306-34849). In breve, le cellule sono state reticolate con l’1% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente, estinte con glicina 0,2M per 5 minuti, pellettate e congelate a scatto in azoto liquido. Le cellule sono state lisate in Lysis Buffer 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolo, 0,5% NP-40, 0,25% Triton X-100). Cromatina reticolata è stato tosato ad una dimensione media di 300 bp utilizzando un Bioruptor con 30 “on / 30” off ad alta impostazione e poi incubato durante la notte a 4 ° C con 1 microgrammo di anticorpo. Dynabeads M-280 Sheep Anti-Mouse IgG (ThermoFisher # 11201D) sono stati utilizzati per tirare giù la cromatina e ChIP DNA è stato eluito e preparato per il sequenziamento utilizzando il kit di preparazione NEBNext Ultra II DNA Library (NEB #E7645S). Le letture ChIP-seq sono state allineate con Bowtie 2-2.2.3 (Langmeade Salzberg, 2012) e i picchi sono stati chiamati con HOMER (Heinzet al., 2010) v4.8.3 su letture uniche con qualità di mappatura >10 utilizzando i parametri dell’istone -regione e -stile -. Picchi significativi sono stati sovrapposti con picchi di H3K27ac da campioni di Epigenome Roadmap che hanno dimostrato un’elevata concordanza tra i tipi di tessuto corrispondenti(Figura 1-figure supplement 2C,D). Poiché abbiamo eseguito un basso livello di sequenziamento, non abbiamo identificato tanti picchi quanti sono i campioni della Roadmap. Pertanto, abbiamo utilizzato i dati Roadmap ChIP-seq in tutte le nostre analisi.

Analisi dell’ontologia genica

Le associazioni di Gene Ontologia umana (GO) dei termini GO(Ashburner et al., 2000) ai geni e il database GO sono stati scaricati il 22 gennaio 2016 da http://geneontology.org/gene-associations. I termini GO sono stati associati ai geni RefSeq tramite simboli genici. Utilizzando il grafico di annotazione GO, tutti i termini dei genitori sono stati assegnati ai termini annotati a un gene. Un test ipergeometrico è stato utilizzato per calcolare la significatività statistica della differenza del numero di geni associati a un dato termine GO in un particolare set di geni e l’universo di tutti i geni RefSeq (p<0,05). p-Valori p sono stati corretti con la funzione p.adjust del pacchetto R utilizzando il metodo ‘fdr’.

Per due dei gruppi di malattie GWAS (insufficienza cardiaca e infarto del miocardio), l’elenco dei geni che fanno il looping dei geni LD SNPs comprendeva molti geni istonici. Questo perché c’è un tag SNP situato al centro di un gruppo di geni istonici (contenente >30 geni istonici situati vicini) in ogni caso. Dopo aver espanso il tag SNP a tutti gli SNP in LD, molti dei geni degli istoni in quel cluster si sono collegati in loop agli SNP LD, ottenendo un’alta rappresentazione di questi geni nella lista finale dei geni. L’analisi di arricchimento dell’ontologia genica risultante ha dato termini relativi all’organizzazione del nucleosoma e della cromatina a causa di questa sovrarappresentazione. Abbiamo quindi scelto di rimuovere questi geni dalle liste genetiche finali dei geni bersaglio dell’insufficienza cardiaca e dell’infarto del miocardio.

Analisi del motivo

Il programma findMotifsGenome.pl del pacchetto HOMER(Heinz et al., 2010) v4.8.3 è stato utilizzato con il parametro -size given parameter per identificare i motivi sovrarappresentati nelle sequenze di interazioni distali (non promoter) che interagiscono con i promotori. Come detto in precedenza, questa analisi è stata eseguita su sequenze frammentarie a livello di promotore-interazione.

Analisi dell’arricchimento di Histone ChIP-seq

Abbiamo ottenuto i dati di ChIP-seq disponibili al pubblico sotto forma di chiamate di picco elaborate per H3K27ac, H3K4me1 e H3K27me3 dal Roadmap Epigenomics Project(Kundaje et al., 2015), e per CTCF da ENCODE(ENCODE Project Consortium, 2012)(file supplementare 10). Abbiamo considerato solo i picchi mappati al di fuori della regione catturata dai promotori per garantire che i nostri risultati non fossero guidati dal forte segnale di picco sulla maggior parte dei promotori. Come proxy per le iPSC, abbiamo usato i dati della linea di cellule staminali embrionali H1 e per le CM abbiamo usato i dati del tessuto del ventricolo sinistro. Abbiamo raggruppato i geni in cinque categorie di espressione in base ai valori medi di TPM: gruppo 1 (0 TPM), gruppo 2 (TPM 0-3), gruppo 3 (TPM 3-25), gruppo 4 (TPM 25-150) e gruppo 5 (TPM >150) e per ogni gruppo di geni, abbiamo calcolato l’arricchimento per le interazioni del promotore per sovrapporre una data caratteristica. Per calcolare l’arricchimento delle interazioni che si sovrappongono ad una caratteristica epigenetica, abbiamo confrontato la proporzione osservata di frammenti MboI in interazioni significative che si sovrappongono ad una caratteristica con la proporzione di frammenti MboI casuali che si sovrappongono alla caratteristica. In particolare, abbiamo selezionato in modo casuale frammenti MboI da un insieme che escludeva la mappatura dei frammenti all’interno delle regioni catturate (promotori) o all’interno di regioni genomiche non mappabili (lacune). Il numero di frammenti selezionati casualmente corrispondeva al numero di frammenti interagenti considerati per l’analisi. Abbiamo eseguito 100 iterazioni di frammenti casuali sovrapposti con una caratteristica e abbiamo riportato l’arricchimento medio delle pieghe. Ci riferiamo a questo metodo di arricchimento come modello di sfondo ‘a livello genomico’, perché per ogni gruppo di espressione genica, la proporzione osservata di frammenti contenenti un picco viene confrontata con frammenti selezionati casualmente dall’intero genoma.

Per calcolare la correlazione tra l’espressione e l’istone ChIP-seq densità di picco, abbiamo calcolato la correlazione del rango di Spearman tra il valore di espressione per ogni gene (il valore medio TPM) e il numero di picchi mappatura entro 300 kb di ogni gene TSS. Abbiamo considerato solo i geni con almeno una interazione significativa nel rispettivo tipo di cellula per consentire generalizzazioni all’analisi di arricchimento presentata in Figura 3.

Analisi GWAS

Abbiamo compilato SNPs significativi a livello genomico associati al GWAS per l’aritmia cardiaca, l’insufficienza cardiaca e l’infarto del miocardio dal database NHGRI-EBI(http://www.ebi.ac.uk/gwas/); vedere il file supplementare 7 per l’elenco dei termini utilizzati per identificare specifici GWAS. Abbiamo esteso ogni set di SNP a tutti gli SNP in alta LD (r2 >0,9) utilizzando i dati della fase 3 del progetto 1000 genomi (Nikpayet al., 2015) (File supplementare 3). Per ogni SNP di piombo dal GWAS che abbiamo analizzato, abbiamo selezionato un intervallo di 100 kb centrato sull’SNP (SNP ± 50 kb). Per ogni intervallo di 100 kb, è stato usato il Tabix(Li, 2011) per recuperare i genotipi. Abbiamo poi usato PLINK(Purcell et al., 2007) v1.90p sui dati della fase tre del progetto 1000 genomi(Nikpay et al., 2015) (ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp/release/20130502, v5a) per selezionare gli SNP in LD (r2 >0.9) con il tag SNP e una frequenza minima di allele di 0.01. Abbiamo incluso solo le popolazioni studiate principalmente nei GWAS: CEU (Europa centrale), ASW (Afroamericana) e JPT (Giapponese). Abbiamo assegnato tutti gli SNP nelle interazioni promotore-distale ai loro geni interagenti (“geni bersaglio”) utilizzando i dati di cattura Hi-C del promotore dei cardiomiociti. Non abbiamo richiesto l’SNP per la mappatura delle regioni associate a cromatina aperta o marchi di rinforzo, in quanto questi tipi di dati sono altamente specifici per il tipo di cellula e non abbiamo voluto escludere gli SNP in regioni che possono essere attive in tipi di cellule non saggiate.

Notiamo che uno dei principali GWAS per la cardiomiopatia dilatativa non è stato incluso nel database NHGRI-EBI(Meder et al., 2014), probabilmente perché c’è un errore nell’ottenere i metodi online del documento. Dopo un’attenta ispezione dello studio, abbiamo concluso che il GWAS soddisfaceva i criteri NHGRI-EBI e abbiamo incluso nella nostra analisi le associazioni di quello studio. Un elenco completo di tutti gli studi utilizzati in questa analisi si trova nel file supplementare 8.

Analisi MGI

Per calcolare l’arricchimento dei geni target per causare fenotipi cardiovascolari quando vengono eliminati nei topi (Mouse Genome Genome Informatics database), abbiamo selezionato a caso 347 geni dalla lista dei geni di partenza (cioè geni con almeno un’interazione promotore-distale nelle CMs, il che significa che potrebbe essere un gene target), e calcolato la proporzione che ha causato un fenotipo cardiovascolare nei topi. Abbiamo eseguito questa selezione randomizzata per 1000 iterazioni per generare i valori randomizzati (attesi). I geni casuali non dovevano essere espressi, in quanto l’insieme dei geni target contiene geni che non sono espressi. p-Valore è stato calcolato con un test Z.

analisi eQTL

Per gli eQTL utilizzati nei confronti delle varianti GWAS e delle interazioni Hi-C, abbiamo utilizzato l’insieme degli eQTL GTEx v7 identificati come significativi nel ventricolo sinistro del cuore(Carithers et al., 2015). Gli eQTL sono stati chiamati significativi se q < 0,05 dopo la correzione del tasso di falsa scoperta (Storey eTibshirani, 2003). Abbiamo considerato solo gli eQTL promotori-distali che erano almeno 10 kb dal loro gene associato per consentire a quell’eQTL di mappare un’interazione con il suo gene associato.

Per calcolare l’arricchimento per gli eQTL da collegare al loro gene associato, abbiamo usato un modello di sfondo in cui l’insieme delle interazioni di ogni promotore è stato mappato di nuovo su un promotore diverso, mantenendo la distanza e l’orientamento del filo coerenti. Abbiamo eseguito questa mappatura di tutte le interazioni del promotore 1000 volte e calcolato la proporzione di tutti gli eQTL che mappano le interazioni per il loro gene associato ad eQTL in ogni permutazione. Abbiamo usato le interazioni CM o le interazioni iPSC con lo stesso insieme di eQTL del ventricolo sinistro per confrontare la specificità del tipo di cellula dei dati di interazione del promotore.

Disponibilità dei dati

I dati di sequenziamento grezzi ed elaborati sono forniti su ArrayExpress attraverso i numeri di adesione E-MTAB-6014 (Hi-C) e E-MTAB-6013 (RNA-seq).

References

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