Replicazione del virus Zika nella zanzara Culex quinquefasciatus in Brasile

INTRODUZIONE

Zika è classicamente considerata una malattia lieve i cui sintomi includono febbre, dolori articolari, eruzioni cutanee e, in alcuni casi, congiuntiviti.¹ Tuttavia, il recente focolaio di Zika in Brasile è stato associato ad una maggiore incidenza di microcefalia neonatale e disturbi neurologici.^{2, 3} Il virus Zika (ZIKV) è un virus RNA poco compreso, piccolo, avvolto in un involucro con ssRNA (+) appartenente alla famiglia Flaviviridae. È stato isolato per la prima volta nell’aprile 1947 da una scimmia rhesus e poi, nel gennaio 1948, dalla specie di zanzara Aedes africanus.⁴ Successivamente, diversi ceppi di ZIKV sono stati isolati dalle zanzare Aedes, Mansonia, Anofele e Culex.⁵

La prima epidemia di Zika conosciuta in ambiente urbano si è verificata in Micronesia nel 2007, con circa il 73% della popolazione umana sull’isola di Yap.⁶ È interessante notare che, sebbene molte zanzare Aedes siano state raccolte sul campo e valutate per il rilevamento del virus, nessun campione è risultato positivo al virus ZIKV.⁶ Inoltre, è importante sottolineare che Ae. aegypti è assente nella maggior parte delle isole dell’arcipelago della Micronesia ed è rara nelle isole dove è presente lo ZIKV.^{6, 7}

C’è un consenso globale tra gli scienziati e le agenzie sanitarie sul fatto che Ae. aegypti e Ae. albopictus sono i principali vettori ZIKV nelle aree urbane (OMS, 2016). Questa convinzione è in parte dovuta al fatto che gli esperimenti di competenza vettoriale per ZIKV sono stati condotti esclusivamente per specie di questo genere, principalmente Ae. aegypti, fino a poco tempo fa.^{8, 9} Infatti, gli studi di laboratorio precedenti^{8, 10} ha suggerito che Ae. aegypti è un vettore ZIKV. Recentemente, in condizioni di laboratorio sono stati osservati alti tassi di diffusione e trasmissione dello ZIKV in Ae. a egypti.¹¹ Curiosamente, alcuni studi hanno dimostrato che le popolazioni di Ae . a egypti e Ae. albopictus hanno bassi tassi di trasmissione dello ZIKV^{12, 13} o nessuno,^{14, 15} ma il ruolo di altri vettori nella diffusione della ZIKV è stato trascurato. Così, altre specie di zanzare, come Cx. quinquefasciatus, che coesistono con Ae. aegypti nelle aree urbane, potrebbero contribuire alla trasmissione dello ZIKV.¹⁶ La letteratura è dicotomica per quanto riguarda i vettori Culex. Anche se ci sono rapporti recenti che dimostrano che Culex non è un vettore ZIKV,^{17, 18, 19, 20, 21, 22} un recente studio ha dimostrato che i Cx. quinquefasciatus raccolti nelle aree urbane della Cina sono stati in grado di essere infettati da un ceppo locale di ZIKV per poi trasmetterlo ai topi.²³ Questi risultati controversi sono attesi e potrebbero essere dovuti a differenze nella combinazione di genotipi di zanzare e virus utilizzati nei test di alimentazione artificiale del sangue, poiché studi precedenti hanno anche mostrato risultati negativi per il principale vettore Ae. aegypti.^{13, 15} Diagne et al.¹⁵ hanno riferito che le popolazioni di Dakar e Kedougou (Senegal) della zanzara della febbre gialla non hanno trasmesso sei diversi ceppi di ZIKV, incluso il ceppo MR766, che è stato isolato per la prima volta da una scimmia sentinella in Uganda. In un evidente contrasto, Wegner-Lucarelli et al.²⁴ hanno scoperto che Ae. aegypti di Poza Rica (Messico) è un vettore competente del ceppo MR766 ZIKV. Questi sono i primi due studi che hanno utilizzato lo stesso ceppo del virus nei confronti della stessa specie di zanzara. Pertanto, è ragionevole concludere che la variabilità genetica delle specie di zanzare di diverse origini geografiche potrebbe spiegare questa apparente discrepanza nei dati riportati.²⁵ Qui riportiamo dati che supportano l’idea che a Recife, nel nordest del Brasile, Cx. quinquefasciatus, la zanzara della casa meridionale nelle aree tropicali e subtropicali, sia un potenziale vettore ZIKV. Abbiamo eseguito test di competenza del vettore zanzara in condizioni di laboratorio, confrontando sia Ae. aegypti che Cx. quinquefasciatus con diverse dosi di virus. ZIKV è stato rilevato nelle ghiandole salivari e nella saliva delle zanzare Cx. quinqu efasciatus alimentate artificialmente. Oltre a questi risultati, ZIKV è stato anche rilevato in campioni prelevati sul campo di Cx. quinquefasciatus, che non aveva segni di recente alimentazione con sangue. ZIKV è stato isolato da questi campioni, e il suo genoma è stato sequenziato, fornendo il primo genoma parziale di ZIKV ottenuto da zanzare Cx. quinqu efasciatus. Collettivamente, i nostri risultati suggeriscono che questa specie è probabilmente un vettore ZIKV in Brasile, che ha diverse implicazioni per le strategie di controllo del vettore così come per la comprensione dell’epidemiologia di ZIKV.

MATERIALI E METODI

Zanzare

Il presente studio è stato condotto utilizzando due colonie di laboratorio di zanzare e campioni raccolti sul campo di Ae. aegypti (_F1-F2) dall’arcipelago di Fernando de Noronha (FN), un distretto dello Stato di Pernambuco (PE). Le zanzare Cx. quinquefasciatus (precedentemente note come Cx. pipiens quinquefasciatus) hanno avuto origine da uova (zattere) raccolte a Peixinhos, un quartiere di Recife, PE, Brasile, nel 2009. La colonia di laboratorio Ae. aegypti (RecLab) è stata fondata con circa 1000 esemplari raccolti a Graças, un quartiere della regione metropolitana di Recife, ed è stata mantenuta nell’insettario dell’Istituto Aggeu Magalhães (IAM)/FIOCRUZ dal 1996 in condizioni standard: 26±2°C, 65%-85% di umidità relativa, 12/12 ciclo luce/buio. Ulteriori informazioni riguardanti le due colonie di laboratorio sono state descritte altrove.^{26, 27} Le zanzare sono state tenute nell’insettario del Dipartimento di Entomologia IAM/FIOCRUZ nelle condizioni standard sopra descritte. Le larve sono state mantenute in vaschette di plastica riempite con acqua potabile e sono state alimentate esclusivamente con cibo per gatti (Friskies), mentre agli adulti è stato dato accesso ad una soluzione di saccarosio al 10% fino a quando non è stato somministrato loro sangue defibrinato di coniglio infetto da ZIKV.

Ceppo virale

Le infezioni sperimentali di zanzare con ZIKV sono state condotte utilizzando il ceppo ZIKV BRPE243/2015 derivato dal siero di un paziente con un’eruzione maculopapulosa acuta nello Stato di Pernambuco, Brasile, durante l’epidemia del 2015.²⁸ Questo ceppo è stato denominato ceppo ZIKV/H. sapiens/Brasile/PE243/2015, secondo la nomenclatura descritta da Scheuermann,²⁹ ed è stato caratterizzato a pieno titolo (numero di adesione KX197192.1). Dopo l’isolamento, il virus è stato trasmesso una volta sulle cellule di Ae. albopictus C6/36. Le scorte virali sono state poi prodotte in cellule VERO e conservate a -80°C fino all’uso. Prima dell’infezione orale, il titolo virale dello stock è stato calcolato tramite il test della placca sulle cellule VERO e ha raggiunto¹⁰⁶ unità di formazione della placca per millilitro (PFU/mL).

Alimentazione artificiale

Due saggi di alimentazione artificiale sono stati condotti utilizzando una concentrazione di stock virale di^{106 PFU/mL} così come una diluizione di 100 volte dallo stock virale in ogni esperimento. In particolare, nel primo test di alimentazione artificiale, il campione di virus congelato è stato mescolato con sangue di coniglio defibrinato. Nel secondo test, ZIKV BRPE243/2015 è stato prima coltivato in cellule VERO ad una molteplicità di infezioni di 0,5 per 4-5 giorni. Successivamente, i flaconi di coltura cellulare sono stati congelati a -80°C, scongelati a 37°C due volte e poi mescolati con sangue di coniglio defibrinato in proporzione 1:1. Le zanzare di sette-dieci giorni sono state affamate per 18 ore prima dell’alimentazione artificiale. Le zanzare sono state esposte ad un pasto di sangue infettivo per 90 minuti, come descritto in Salazar et al ,³⁰ con piccole modifiche. In breve, il sangue infettivo è stato fornito in un dispositivo di alimentazione a membrana posto su ogni gabbia di zanzare. L’alimentazione del sangue è stata mantenuta a 37°C utilizzando pacchetti di calore durante il processo. Le femmine di zanzara completamente ingorgate sono state anestetizzate a freddo, trasferite in una nuova gabbia e mantenute nella stanza delle infezioni per 15 giorni. Entrambi i test includevano un gruppo di controllo alimentato con cellule coltivate non infette e mischiate con sangue di coniglio defibrinato.

Estrazione dell’RNA e rilevamento del virus

Da quattro a quindici zanzare sono state sezionate per raccogliere le interiora e le ghiandole salivari a tre, sette e 15 giorni dopo l’infezione (dpi). Per prevenire la contaminazione emolinfatica, tutte le interiora e le ghiandole salivari sono state ampiamente lavate con tampone salino fosfato tampone immediatamente dopo la dissezione e prima dell’estrazione del tessuto. I tessuti sono stati trasferiti individualmente in un microtubo da 1,5 ml di DNAse/RNAse-free contenente 300 ml di diluente per zanzare³¹ e sono stati conservati a -80°C fino a nuovo uso. Ogni tessuto è stato macinato con micropestelli sterili, e l’estrazione dell’RNA è stata effettuata con 100 μL di omogeneizzato. Il metodo TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA) è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore con le seguenti modifiche. Tissue homogenate (100 μL) è stato miscelato con 200 μL di TRIzol, omogeneizzato mediante vortex per 15 s e incubato per 5 minuti a temperatura ambiente. Cloroformio (100μL) è stato aggiunto alla miscela, e l’omogeneizzazione è stata effettuata agitando vigorosamente le provette per 15&s a mano. La miscela è stata poi incubata a temperatura ambiente per 2-3 minuti. I campioni sono stati centrifugati a 12 000g per 15min a 4°C. La fase acquosa di ogni campione è stata rimossa e trasferita in una nuova provetta contenente 250 μL di isopropanolo al 100%. Questa miscela è stata incubata a temperatura ambiente per 10 minuti e poi centrifugata a 12000g per 10 minuti a 4°C. Il surnatante è stato rimosso, e il pellet di RNA è stato lavato con 300 μL di etanolo al 75%. I campioni sono stati omogeneizzati brevemente e poi centrifugati a 7500g per 5 minuti a 4°C. Il supernatante è stato scartato, e l’RNA è stato poi essiccato all’aria per 15 minuti. Il pellet di RNA è stato risospeso in 30 ml di acqua priva di RNA. Dopo la risospensione dell’RNA, i campioni sono stati trattati con DNAse (Turbo DNase, Ambion, Foster City, CA, USA) secondo il protocollo del produttore.

Il rilevamento del virus è stato effettuato mediante RT-PCR quantitativa (RT-qPCR, noto anche come RT-PCR in tempo reale) in un sistema ABI Prism 7500 SDS Real-Time (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA) utilizzando il kit QuantiNova Probe RT-PCR (Qiagen, Hilden, Germania). RT-qPCR è stato eseguito in un volume di reazione di 20 μL contenente 5 μL di RNA estratto, 2 × QuantiNova Probe RT-PCR Master Mix, 0,2 μL del QuantiNova Probe RT Mix, 0,1 μL del ROX Reference Dye, 100 μM di ogni primer (stock) e 25 μM della sonda (stock). Le condizioni dei primer, della sonda e della PCR sono state descritte per la prima volta in Lanciotti et al.,³² e ogni campione è stato testato in doppio. Il ciclo RT-qPCR comprendeva un singolo ciclo di trascrizione inversa per 15 minuti a 45°C, seguito da 5 minuti a 95°C per l’inattivazione della trascrittasi inversa e l’attivazione della DNA polimerasi, e poi 45 cicli di 5 a 95°C e 45 a 60°C (fase di ricottura-estensione). La quantità di RNA virale in ogni campione è stata stimata confrontando i valori di soglia del ciclo (Ct) con la curva standard per ogni test RT-qPCR. La curva standard consisteva di diverse diluizioni di RNA ZIKV BRPE243/2015 precedentemente titolato. Le zanzare raccolte immediatamente dopo l’alimentazione artificiale sono state utilizzate come controlli positivi, mentre le zanzare di controllo alimentate con sangue non infetto e le reazioni RT-PCR che non contengono RNA rappresentavano controlli negativi. La fluorescenza è stata analizzata alla fine delle amplificazioni. I campioni positivi sono stati utilizzati per calcolare i parametri di competenza del vettore, come il tasso di infezione (IR), che è il numero di interiora positive diviso per il numero totale di interiora testate, e la proporzione di ghiandole salivari infette (SR), che è il numero di ghiandole salivari positive diviso per il numero totale di ghiandole salivari testate.

Raccolta di saliva di zanzara infetta da virus

Per confermare se l’RNA virale rilevato da RT-qPCR all’interno delle ghiandole salivari era infettivo e poteva essere rilasciato durante i pasti a base di sangue, abbiamo saggiato ZIKV da campioni di saliva. Dall’8° al 14° dpi, le zanzare di ogni gruppo sono state esposte alle Carte Classiche di Flinders Technology Associates (FTA) imbevute di miele (Whatman, Maidstone, Regno Unito) poste sulla parte superiore delle gabbie per raccogliere la saliva delle zanzare. Ogni carta FTA è stata preparata in una capsula Petri sterilizzata e immersa in ~10 g di miele antibatterico (Manuka Honey Blend, Arataki Honey Ltd, Havelock North, Havelock North, Hastings, Nuova Zelanda) e 1 ml di colorante alimentare blu (Soft Gel Mix) per 2 ore. Il colorante alimentare blu è stato utilizzato per determinare se le zanzare si erano nutrite con le carte FTA. Dopo 24 ore di esposizione, ogni carta è stata messa in una provetta di falco da 15 ml e conservata a -80°C fino a nuovo uso. Per estrarre l’RNA, le schede sono state collocate singolarmente in microtubi da 2 ml con 600 ml di UltraPureDNase/RNase-Free Distilled Water (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Questi campioni eluiti sono stati tenuti in ghiaccio e vortexati cinque volte per dieci volte ciascuno. Questo processo è stato ripetuto per 20 minuti. L’RNA è stato recuperato dalle carte FTA utilizzando il metodo TRIzol ed è stato utilizzato per rilevare ZIKV come descritto in precedenza.

Microscopia elettronica a trasmissione

Le ghiandole salivari di Cx. quinquefasciatus sono state sezionate a 7 dpi e fissate per 2 ore in una soluzione contenente il 2,5% di glutaraldeide e il 4% di paraformaldeide in soluzione tampone di cacodilato 0,1 M. Dopo la fissazione, i campioni sono stati lavati due volte nello stesso tampone e post-fissati in una soluzione contenente 1% di tetraossido di osmio, 2 mg di cloruro di calcio e 0,8% di ferricianuro di potassio in 0,1 mg di cacodilato tampone, pH 7,2, disidratato in acetone come precedentemente riportato,³³ e sono stati poi incorporati utilizzando un kit di incorporazione epossidica Fluka (Fluka Chemie AG, Buchs, Svizzera). La polimerizzazione è stata effettuata a 60°C per 24 ore. Le sezioni ultrasottili (70 nm) sono state posizionate su griglie di nichel a 300 mesh e poi controbilanciate con il 5% di acetato di uranile e citrato di piombo, seguite da un esame al microscopio elettronico a trasmissione (Tecnai Spirit Biotwin, FEI Company, Hillsboro, OR, USA).

Analisi statistica

L’IR e l’SR sono stati calcolati per ogni specie in punti temporali diversi. La regressione logistica, il χ 2-teste i test di Fisher’s Exact sono stati utilizzati per verificare le differenze sia nella IR che nella SR all’interno delle due specie. I test di regressione lineare Cochran-Mantel-Haenszel e log sono stati anche eseguiti per confrontare le differenze tra le specie. Tutti i test statistici sono stati eseguiti con il software R (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2012). Il software GraphPad Prism v.5.02 (GraphPad, San Diego, CA, USA) è stato utilizzato per tracciare grafici e per confrontare i valori di quantificazione del genoma virale tra i diversi punti temporali, tessuti e campioni utilizzando un t-test non accoppiato.

Rilevamento di ZIKV e isolamento virale nelle zanzare raccolte sul campo

I campioni di zanzara sono stati raccolti nella regione metropolitana di Recife, da febbraio a maggio 2016, in due tipologie distinte: in locali dove sono stati rilevati i casi di zika e presso i reparti di pronto soccorso pubblici. Il personale del Segretario della Sanità di Pernambuco ha effettuato le raccolte presso le unità di pronto soccorso, e il nostro team di lavoro sul campo ha raccolto le zanzare nei locali con infezioni da Zika. Entrambe le serie di raccolte sono state effettuate utilizzando un aspiratore a batteria (Horst Armadilhas Ltd, São Paulo, Brasile). I campioni sono stati inviati vivi allo IAM dove sono stati anestetizzati a 4°C; identificati morfologicamente; ordinati per specie, località, sesso e stato di alimentazione (ingorgati e non ingorgati); messi in pool (1-10 individui/pool); e conservati a -80°C fino ad essere analizzati per l’estrazione dell’RNA e RT-qPCR come descritto sopra. Il minimo IR (MIR) per ZIKV negli adulti catturati sul campo è stato calcolato come (il numero di pool positivi per ZIKV/numero totale di zanzare testate) × 1000.³⁴

I campioni positivi sono stati analizzati per l’isolamento del virus nelle cellule VERO come segue. In una provetta di coltura tissutale (Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Sciaffusa, Svizzera), 1 ml di una sospensione di 5 × 105 cellule/ml in MEM (Minimum Essential Media) è stato seminato per 24 ore per formare un monostrato. Dopo di che, il mezzo MEM è stato scartato, e 1 ml del filtro omogeneizzato (100 ml di omogeneizzato positivo + 900 ml di mezzo MEM) è stato inoculato nelle cellule. Dopo un’incubazione di 1 ora per l’adsorbimento del virus, 1 ml di terreno fresco è stato aggiunto alle provette di coltura tissutale, e sono state poi incubate a 37°C in atmosfera al 5% di CO2 fino alla rilevazione degli effetti citopatici. Dopo di che, i campioni sono stati congelati e scongelati due volte, seguiti da centrifugazione per 10 minuti a 2000 r/min. I supernatanti sono stati poi trasferiti in criotubi e conservati a -80°C fino al successivo utilizzo.

Sequenziamento del genoma

Due campioni positivi raccolti sul campo di Cx. quinquefasciatus (Cx5 e Cx17) identificati in precedenza da RT-qPCR sono stati inoculati in cellule VERO per la replicazione del virus per ottenere ZIKV primo passaggio. Per il sequenziamento del genoma, RNA totale da ogni campione è stato estratto dalle colture cellulari VERO utilizzando il reagente TRIzol come descritto sopra. Un MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA) libreria di sequenziamento è stato preparato con un Nextera XT Library Prep Kit (Illumina) utilizzando 2ng di cDNA in ingresso da PCR multiplex PCR seguendo le istruzioni del produttore. Per ottenere cDNA, le reazioni RT-PCR sono state effettuate in un volume di 25 μL utilizzando un SuperScript III Platinum One-Step RT-qPCR Kit (Invitrogen, Life Technologies) con modifiche. In breve, il primo filamento di cDNA è stato trascritto al contrario dall’RNA precedentemente estratto (minimo 10 ng per la reazione) a 50°C per 30 minuti, e sono stati utilizzati degli esametri casuali (sequenza casuale [d(N)6]) come primer del primo filamento. Dopo la trascrizione inversa, è stato eseguito un programma di PCR per amplificare l’intero genoma ZIKV. I primer per l’amplificazione del genoma ZIKV sono stati descritti dal progetto ZIBRA.³⁵ Un totale di 35 cicli di 95°C per 5 s e 65°C per 15 minuti sono stati eseguiti su un Veriti Thermal Cycler (Invitrogen, Life Technologies). Come descritto dal protocollo ZIBRA, sono stati progettati due diversi set di primer per una PCR multiplex e le reazioni di amplificazione di ciascun set di primer sono state eseguite separatamente su singoli campioni. Dopo l’amplificazione, i prodotti di PCR sono stati quantificati utilizzando un kit di analisi Qubit dsDNA HS (Invitrogen, Life Technologies). Un MiSeq Reagent Kit V3 di 150 cicli è stato utilizzato per sequenziare entrambi i campioni utilizzando una strategia di paired-end, che dovrebbe portare a letture di 75 bp separate da ~350 bp. La sequenza è stata eseguita sulla piattaforma MiSeq (Illumina) presso il nucleo della piattaforma tecnologica dello IAM.

Legge il controllo qualità e la mappatura

Le letture grezze sono state elaborate da Trimmomatic v 0,35³⁶ per l’adattatore e la rimozione delle letture di bassa qualità. FASTQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) è stato utilizzato per controllare l’uscita Trimmomatic, e Bowtie 2³⁷ è stato utilizzato per mappare le letture rispetto al genoma di riferimento ZIKV BRPE243/2015 (KX197192).²⁸

Analisi spaziale

Abbiamo georeferenziato i punti da cui sono state raccolte le zanzare utilizzando il WGS-84 (World Geodesic System), un ricevitore GPS che elaborava i dati nel software QGIS. Abbiamo generato un database geografico ed eseguito un’analisi della densità del kernel basata sulla distribuzione spaziale dei casi di microcefalia registrati dal Dipartimento della Salute di Pernambuco. La mappa illustrata mostra una sovrapposizione tra la posizione del campionamento delle zanzare e la mappa della densità del kernel dei casi di microcefalia segnalati da agosto 2015 a marzo 2016.

RISULTATI

Saggi di competenza vettoriale

Un totale di 289 zanzare sono state esaminate per l’infezione da ZIKV da RT-qPCR. Tra queste zanzare, 130 erano Ae. aegypti RecLab, 60 erano Ae. aegypti Fernando de Noronha (FN) e 99 erano Cx. quinquefasciatus.

L’analisi suggerisce che, in generale, tutti i ceppi(Ae. aegypti RecLab, Ae. aegypti FN e Cx. quinquefasciatus) sono in grado di trasmettere ZIKV quando sono alimentati artificialmente con ZIKV. Confrontando i ceppi di laboratorio, al titolo virale più alto, l’IR e l’SR determinati per entrambe le specie erano simili (IR, P=0,2270; SR, P=1,0000; Tabella 1). Abbiamo anche osservato che a 7 dpi entrambe le specie presentavano il più alto IR e SR. Quando a questi ceppi di laboratorio è stata somministrata una dose virale di^{104 PFU/mL}, sono state osservate IR e SR più basse per entrambe le specie, a parte la IR di Ae. aegypti a 15 dpi e la sua SR, che è aumentata nel più breve periodo di incubazione estrinseca (3 dpi). Complessivamente, a 7 dpi, le due specie non si sono differenziate in modo significativo sia per la IR (P=0,5590) che per la SR (P=1,0000), ad eccezione della SR a 106 PFU/mL (P=0,0100; Tabella 1). Per quanto riguarda il ceppo raccolto in campo, Ae. aegypti FN, non c’era differenza tra la IR per le dosi virali basse e alte, ma la differenza per la SR era statisticamente significativa(Tabella 2). Abbiamo anche campionato le zanzare a 11 dpi nella prima prova, ad eccezione del ceppo Ae. aegypti (FN) raccolto sul campo, e, anche se non è stata rilevata alcuna IR, è stato osservato un 10% di SR a questo particolare dpi. Né Cx. quinquefasciatus né Ae. a egypti RecLab era ZIKV-positivo a 11 dpi (dati non mostrati).

RT-qPCR è stato utilizzato per quantificare il carico di ZIKV RNA a 3, 7 e 15 dpi. In generale, le copie di RNA virale in Ae. aegypti RecLab variava notevolmente nelle midguts e nelle ghiandole salivari(Figure 1A-1D). Le copie virali negli organi bersaglio (midguts e ghiandole salivari) di Ae. aegypti FN e Cx. quinquefasciatus sono rimaste rilevabili nella maggior parte dei punti temporali studiati(Figure 1A-1D). Per confermare le particelle infettive ZIKV nelle ghiandole salivari, due Ae. aegypti RecLab e due campioni Cx. quinquefasciatus-positiviraccolti a 7 dpi sono stati inoculati in cellule VERO per 10 giorni. Dopo di che, l’RNA è stato estratto e RT-qPCR è stato eseguito, i Cts del Ae. aegypti a egypti e Cx. quinquefasciatus-positivi piscine dal loro primo passaggio in cellule VERO quando screening RT-qPCR erano 34,0. Per valutare la trasmissione di ZIKV nella saliva per entrambe le specie, sono state collocate carte da filtro imbevute di miele (FTA Classic Cards, Whatman) sulla parte superiore di ogni gabbia contenente zanzare per alimentarsi da 8 a 14 dpi. A 9-12 dpi, ZIKV RNA è stato rilevato nella saliva di entrambe le specie Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus (Figura 2). Quando è stata utilizzata una dose virale elevata (¹⁰⁶), la quantità di copie di RNA virale espettorato durante la salivazione sia in Ae. a egypti e Cx. quinqu efasciatus sono stati simili in tutti i punti di tempo analizzati(P> 0,05). Tuttavia, quando le zanzare sono state contestate con una bassa dose virale (¹⁰⁴), Ae. aegypti ha espettorato più copie virali di RNA rispetto a Cx. quinquefasciatus(P=0.0473). È importante sottolineare che non abbiamo informazioni per quanto riguarda il numero di zanzare che espettorano il virus sulle schede FTA per gabbia. Il numero di zanzare che saliva sulle schede potrebbe influenzare le quantità di particelle ZIKV rilevate da RT-qPCR.

Microscopia elettronica a trasmissione

Per esaminare ulteriormente i nostri risultati da RT-qPCR, abbiamo eseguito la microscopia elettronica a trasmissione delle ghiandole salivari sezionate dalle zanzare Cx. quinquefasciatus. L’organizzazione morfologica delle ghiandole salivari Cx. quinquefasciatus Cx. ha mostrato una cavità apicale ad alta densità di elettroni con proiezioni di membrana che si estende dalla parete(Figura 3A), oltre ad un nucleo basale, mitocondri e reticolo endoplasmatico abbondante(Figura 3B). ZIKV-infetto cellule acinar salivari di Cx. quinquefasciatus ha mostrato segni di disturbi citopatici, tra cui la distensione cisternae del reticolo endoplasmatico e membrane tubolari proliferanti organizzati in diverse patch all’interno di una singola cellula, presentando centri filiformi(Figure 3C e 3D). All’interno del reticolo endoplasmatico dilatato sono state osservate particelle ZIKV mature di 40-50 nm di diametro, composte da un nucleo centrale elettrodenso (~30 nm di diametro) circondato da un involucro virale (Figure 4A-4D). In alcune regioni, la formazione dell’inviluppo virale è stato dimostrato di sorgere dalla membrana endoplasmatica(Figura 4B). Alcune particelle ZIKV sono stati osservati prossimale alla cavità apicale della cellula salivare. Mitocondri hanno anche mostrato gravi danni, tra cui la perdita completa di cristae(Figura 4D). In sintesi, l’analisi al microscopio elettronico a trasmissione ha confermato che le zanzare Cx. quinquefasciatus sono suscettibili di infezione da ZIKV perché le particelle virali sono state rilevate nelle ghiandole salivari delle zanzare alimentate artificialmente.

Rilevamento di ZIKV in campo catturati Cx. quinquefasciatus

Infine, abbiamo condotto la sorveglianza ZIKV (da febbraio a maggio 2016) in zanzare raccolte in residenze abitate da individui con sintomi clinici di febbre Zika. Un totale di 1496 zanzare adulte Cx. quinquefasciatus e 408 Ae. aegypti femminili sono state raccolte da diversi siti nella regione metropolitana di Recife(Figura 5). Da 270 campioni raggruppati di femmine adulte Cx. quinqu efasciatus e 117 gruppi di zanzare aegypti Ae. saggiate da RT-qPCR, tre gruppi di Cx. quinquefasciatus e due gruppi di Ae. aegypti sono risultati positivi al ZIKV. È interessante notare che l’analisi colorimetrica non ha indicato alcuna traccia di sangue non digerito in due dei tre campioni di Cx. quinqu efasciatus positivi e di sangue non digerito nei due pool di Ae. aegypti positivi. Questi risultati suggeriscono che, almeno nei due campioni Cx. quinqu efasciatus ZIKV-positivi, il virus non è stato derivato da un recente pasto di sangue. I Cts dei pool Cx. quinquefasciatus-positivi al momento dello screening RT-qPCR erano 37,6 (campione 5), 38,0 (campione 17) e 38,15 (campione 163). Per i pool Ae. aegypti, i Cts erano 37,5 (campione 3) e 37,9 (campione 7). Il MIR è stato calcolato per entrambe le specie; per il Cx. quinquefasciatus, il MIR era del 2,0‰ e per Ae. aegypti il MIR era del 4,9‰. Nel tentativo di isolare ZIKV dalle zanzare Culex catturate sul campo, abbiamo inoculato cellule renali di scimmia verde africana (cellule VERO) con campioni provenienti da due pool positivi con i Cts più bassi. ZIKV è stato isolato da questi campioni, dimostrando così in modo inequivocabile che questa specie trasportava particelle attive di ZIKV a Recife, in Brasile.

Sequenziamento del genoma ZIKV da Cx. quinquefasciatus catturati sul campo

ZIKV è stato ottenuto dal primo passaggio di due pool di Cx. quinquefasciatus catturati sul campo in celle VERO . Questi virus sono stati chiamati ZIKV/C. quinquefasciatus/Brasile/PE05/2016(Cx5) e ZIKV/C. quinquefasciatus/Brasile/PE17/2016(Cx17). Da questi campioni abbiamo ottenuto due progetti di genomi ZIKV lunghi 5365 (Cx5) e 5380 (Cx17) nucleotidi, che coprono più del 50% del genoma del virus ad una profondità di copertura media di 13,32 e 12,18 ×, rispettivamente. I due genomi parziali sono stati depositati in GenBank sotto i numeri di adesione KX986760 e KX986761, rispettivamente.

L’allineamento di sequenza del ZIKV PE243/2015 con il genoma parziale Cx5 ha rilevato un polimorfismo mononucleotidico (SNP) nella regione dell’involucro ZIKV del campione di zanzara. Un confronto tra PE243 e Cx17 ha mostrato la presenza di 10 diversi SNP nel genoma parziale ZIKV del Cx17. Sei e quattro SNPs sono stati trovati rispettivamente nelle regioni NS3 e NS5. I primi cinque SNP trovati nella regione NS3 sono stati supportati da 11 letture, mentre l’ultimo è stato supportato da cinque letture. Tutti e quattro gli SNP osservati nella regione NS5 sono stati supportati da sette letture.

DISCUSSIONE

Il nostro lavoro ha associato un secondo genere di zanzare al ciclo di trasmissione ZIKV nel nordest del Brasile. Abbiamo dimostrato che la Cx. quinquefasciatus, conosciuta anche come zanzara domestica del sud, che è la zanzara più comune nelle aree urbane del Brasile, è suscettibile di infezione da ZIKV durante l’alimentazione sperimentale del sangue; inoltre, abbiamo scoperto che la ZIKV ha un ciclo di replicazione attivo nelle ghiandole salivari e viene successivamente rilasciata nella saliva. Inoltre, siamo stati in grado di rilevare ZIKV circolante in Cx. quinquefasciatus selvatico raccolto da Recife, e, per la prima volta, abbiamo sequenziato una regione parziale di un genoma ZIKV (50%) ottenuto da campioni di zanzara in Brasile.

Sebbene Ae. aegypti sia ampiamente considerato il principale vettore ZIKV, gli studi precedenti sulla competenza dei vettori sono controversi. Nel presente studio è stata utilizzata una bassa dose di ZIKV (^{104 PFU/mL}) per il confronto con le dosi più elevate utilizzate negli studi precedenti.^{11, 12, 15} Abbiamo scoperto che sia Ae. aegypti che Cx. quinquefasciatus possono essere infettati sperimentalmente da ZIKV anche a basse dosi e possono successivamente espettorare ZIKV nella loro saliva.

Cornet et al.¹⁰ hanno concluso che parte di una popolazione di zanzare infette potrebbe non essere in grado di trasmettere il virus e che, anche se lo facessero, la trasmissione avviene in un determinato lasso di tempo. Questa ipotesi differisce dall’idea che, una volta infettata, una zanzara trasmetta il virus per tutta la vita. Questa constatazione ha implicazioni per i programmi di sorveglianza dell’arbovirus in quanto può esistere una finestra temporale per la trasmissione di ZIKV vettoriale. Abbiamo scoperto che dopo 11 dpi, la maggior parte dei campioni erano negativi per lo ZIKV (a parte una ghiandola salivaria positiva di Ae. aegypti alimentata a^{106 PFU/mL}); quindi, la nostra analisi del punto di tempo massimo è stata impostata a 15 dpi. Tuttavia, Boorman e Porterfield⁸ ha riferito che la replicazione del virus è ripresa a 15-20 dpi, e lo ZIKV è rimasto presente nelle zanzare di Aedes per un massimo di 60 giorni.

Per confermare che il virus rilevato nelle ghiandole salivari da RT-qPCR veniva rilasciato nella saliva durante i pasti consecutivi di sangue, abbiamo seguito la carica virale da 8 a 14 giorni dopo l’infezione utilizzando schede di carta da filtro. Le carte FTA sono state sempre collocate sulla parte superiore delle gabbie per evitare la contaminazione degli escrementi, come osservato negli studi precedenti.^{38, 39} Questa strategia di rilevamento dell’RNA virale direttamente dalle carte FTA è stata impiegata in studi precedenti per la sorveglianza dell’arbovirus.^{40, 41} Nel presente studio, abbiamo rilevato con successo copie di ZIKV RNA nelle carte di Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus zanzare. Questo risultato dimostra che, oltre ad essere suscettibili all’infezione da ZIKV e a permettere la replicazione del virus nelle ghiandole salivari, entrambe le specie sono in grado di trasmettere efficacemente ZIKV.

I risultati RT-qPCR sono stati confermati dalla microscopia elettronica a trasmissione. La morfologia generale matura ZIKV osservato per le ghiandole salivari ha confermato precedenti studi ultrastrutturali.^{42, 43, 44} Nelle cellule delle ghiandole salivari, la replicazione di ZIKV provoca effetti citopatici da 7 dpi, come la proliferazione delle membrane tubolari, simili ai risultati mostrati altrove per il virus del Nilo occidentale.^{45, 46} Il fatto che abbiamo trovato le ghiandole salivari positive per lo ZIKV quando il midgut della stessa zanzara era negativo indica che le zanzare possono cancellare l’infezione virale nel midgut mentre la replicazione del virus continua nelle ghiandole salivari. Questa scoperta ha implicazioni per i metodi analitici impiegati negli studi di competenza vettoriale.

È interessante notare che siamo stati in grado non solo di dimostrare l’infezione da ZIKV in Cx. quinquefasciatus nei saggi di laboratorio, ma anche nelle zanzare catturate sul campo . I virus isolati da Cx. quinqu efasciatus catturati sul campo sono stati passati in cellule VERO e sequenziati e sono state rilevate mutazioni nelle regioni NS3 e NS5. Queste particolari regioni comprendono una elicasi RNA (NS3-Hel) e una presunta RNA polimerasi RNA-dipendente (NS5-RdRp), che sono componenti chiave per la replicazione del genoma e la sintesi di RNA.⁴⁷ Inoltre, più in particolare, questi polimorfismi non sono stati identificati nel ceppo ZIKV circolante in Recife (PE243) che è stato ottenuto da sieri umani. I nostri risultati sono supportati da Guo et al.,²³ ma siamo a conoscenza di studi precedenti che non sono stati in grado di confermare la replicazione di ZIKV in Cx. quinquefasciatus.^{17, 18, 21, 24, 48}

I primi studi hanno preso di mira solo le specie di Aedes, e solo studi recenti hanno confrontato le IR naturali di diverse specie (tra cui Culex). In particolare, Diallo et al.⁵ hanno osservato un MIR più alto per Cx. perfuscus (10 × più alto) rispetto ad Ae. aegypti . Campioni di campo di Ae . a egypti positivi sono sempre stati riportati a IR molto bassi, anche in aree con IR ZIKV umani elevati, come la Malesia.⁴⁹ Infatti, in Micronesia⁶ e della Polinesia francese, lo ZIKV non è stato rilevato nelle zanzare Aedes spp. catturate allo stato brado durante le epidemie. È interessante che in tutte queste aree, Cx. quinquefasciatus è una specie di zanzara abbondante che può anche aver avuto un ruolo non rilevato nella trasmissione di ZIKV. Infatti, Richard et al.¹³ hanno dimostrato che due specie di Aedes della Polinesia francese non hanno dimostrato una competenza vettoriale sufficiente per trasmettere lo ZIKV e hanno suggerito che un’altra specie di zanzara potrebbe contribuire alla diffusione del virus in quella regione.

Pertanto, i nostri risultati indicano che le strategie di controllo dei vettori potrebbero dover essere riesaminate, poiché la riduzione delle popolazioni di Ae . aegypti potrebbe non portare a una riduzione complessiva della trasmissione dello ZIKV se le popolazioni di Culex non sono interessate dalle misure di controllo specifiche di Aedes. Al momento, non esiste un ampio programma in corso per il controllo del Cx. quinquefasciatus in Brasile, sebbene Recife, Olinda e Jaboatão dos Guararapes, tre comuni della regione metropolitana di Recife, abbiano intrapreso un controllo specifico del Cx. quinquefasciatus per controllare localmente la trasmissione della filariosi linfatica (LF),⁵⁰ poiché questa specie è l’unico vettore LF.

La trasmissione virale tramite Cx. quinquefasciatus non è un concetto nuovo; in Nord America, questa specie è il principale vettore del virus del Nilo occidentale.⁵¹ ed è anche un noto vettore del virus dell’encefalite giapponese⁵² e il virus dell’encefalite equina.⁵³ I nostri dati indicano che le zanzare Cx. quinquefasciatus possono essere coinvolte nella trasmissione di ZIKV a Recife. Pertanto, la comprensione dei contributi di ciascuna specie nella trasmissione di ZIKV è necessaria per poterla individuare correttamente. In conclusione, considerando la sua elevata abbondanza in ambienti urbani e il suo comportamento antropofilo in Brasile,^{54, 55, 56}
Cx. quinquefasciatus può essere un vettore per ZIKV in questa regione.

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