Stimolazione genetica magnetotermica cerebrale profonda dei comportamenti motori nei topi svegli e in movimento

Abstract

Stabilire come l'attivazione dei neurocircuiti provoca particolari comportamenti richiede la modulazione dell'attività di specifici neuroni. Qui, dimostriamo che la stimolazione genetica magnetotermica fornisce un'attivazione cerebrale profonda senza legami, sufficiente ad evocare il comportamento motorio nei topi svegli. L'approccio utilizza campi magnetici alternati per riscaldare le nanoparticelle superparamagnetiche sulla membrana neuronale. I neuroni sensibili al calore esprimendo TRPV1 vengono attivati con l'applicazione del campo magnetico. La stimolazione genetica magnetotermica nella corteccia motoria ha evocato la deambulazione, la stimolazione cerebrale profonda nello striato ha causato la rotazione intorno all'asse corporeo, e la stimolazione vicino alla cresta tra striato ventrale e dorsale ha causato il congelamento dell'orbita. La durata del comportamento è strettamente correlata con l'applicazione sul campo. Questo approccio fornisce un'attivazione geneticamente e spazialmente targetable, ripetibile e temporaneamente precisa dei circuiti cerebrali profondi senza bisogno di impianto chirurgico di alcun dispositivo.

Introduzione

L’identificazione dei circuiti neurali che controllano specifici comportamenti richiede la capacità di comunicare con specifici neuroni nel cervello di animali svegli e in movimento. L’interfaccia più consolidata è quella degli elettrodi impiantati nel cervello. Essi forniscono una rapida stimolazione neuronale e registrazione, tuttavia, a costo di essere invasivi e con un limitato targeting spaziale e di tipo cellulare. L’optogenetica, la stimolazione basata sulla luce visibile dei neuroni geneticamente modificati per esprimere i canali di luce e le pompe ioniche, fornisce il targeting genetico di specifici tipi di cellule in combinazione con la stimolazione rapida(Banghart et al., 2004; Boyden et al., 2005). Il metodo ha rapidamente guadagnato popolarità ed è stato utilizzato in vari modelli animali per studiare i circuiti cerebrali associati al morbo di Parkinson (Gradinaruet al., 2009; Kravitz et al. , 2010), il comportamento di dipendenza (Chen et al.,2013; Stefanik et al., 2013 ), la depressione (Nieh et al., 2013; Zhu et al., 2016) e l’ansia (Tye et al.,2011). Tuttavia, l’optogenetica richiede impianti cerebrali permanenti per guidare la luce nel cervello, e in genere, una fibra ottica, legando l’animale alla fonte di luce. Un terzo approccio, la neuromodulazione farmacologica che utilizza i GPCR Designer GPCRs Attivati esclusivamente dai Designer Drugs (DREADDs), fornisce un’alternativa senza fili all’optogenetica, ma genera una risposta molto più lenta, che va da decine di minuti a ore, poiché il farmaco deve diffondersi fino al luogo dell’azione(Armbruster et al., 2007; Urban e Roth, 2015). L’approccio sperimentale ideale per la stimolazione cerebrale profonda combinerebbe una minima invasività – per evitare di perturbare il comportamento, una velocità sufficiente – per consentire una risposta in tempo reale e un targeting specifico per le cellule.

La stimolazione basata sul campo magnetico ha un notevole potenziale per fornire una stimolazione cerebrale profonda veloce, senza legami e senza impianti, perché i campi magnetici sono minimamente dispersi, minimamente assorbiti dai tessuti e viaggiano liberamente nello spazio(Walsh e Cowey, 2000). Queste caratteristiche della stimolazione magnetotermica semplificano una serie di saggi sperimentali, che sono impegnativi da eseguire con le tecniche attuali, e permettono nuovi tipi di esperimenti: L’assenza di attacchi permetterà nuovi test comportamentali sociali in un gruppo di animali che interagiscono liberamente in un’arena, mentre solo un sottogruppo di essi viene stimolato. Poiché la stimolazione magnetica avviene solo quando l’animale risiede all’interno del campo magnetico, la geometria del campo può essere adattata in modo che coincida con un altro segnale per la preferenza di luogo condizionale o per i saggi di alimentazione. Allo stesso modo, la stimolazione magnetica di più siti in un cervello per studiare la connettività di rete richiede solo iniezioni multiple di soluzioni, possibilmente lungo un percorso di iniezione condiviso, in contrapposizione agli impianti di cannule multiple. Inoltre, l’assenza di qualsiasi connessione fisica dal cervello al cranio riduce al minimo i danni ai tessuti e la risposta immunitaria(Chen et al., 2015). Infine, i saggi che utilizzano animali facilmente spaventati dai lampi di luce visibile utilizzati in optogenetica, come Zebrafish, beneficerebbero della stimolazione magnetica. Pertanto, un metodo affidabile di stimolazione del campo magnetico non solo semplificherebbe gli esperimenti, attualmente eseguiti con le tecniche esistenti, ma consentirebbe una serie di nuovi test.

La sfida nell’implementazione della stimolazione magnetica è stata quella di sviluppare un trasduttore in grado di sfruttare l’energia del campo magnetico e di tradurla in un segnale biologico robusto con un’elevata specificità temporale e spaziale. I campi magnetici interagiscono solo con i dipoli magnetici. Il dipolo magnetico complessivo di una particella è causato dal momento magnetico intrinseco della particella, che risulta dall’orientamento di un gran numero di rotazioni degli ioni che compongono la nanoparticella. Le rotazioni in un ferromagnete interagiscono fortemente, causando il loro allineamento parallelo a persistere nel tempo e creando un momento magnetico permanente. Nelle particelle ferromagnetiche, il momento magnetico è fissato alla struttura cristallina della particella, causando un dipolo magnetico netto della particella, che interagisce fortemente con i campi magnetici esterni. Tuttavia, i dipoli permanenti delle singole particelle interagiscono anche in assenza di un campo esterno, causando l’aggregazione di particelle, rendendole inadatte alla neurostimolazione.

In particelle molto piccole, costituite da materiali ferromagnetici alla rinfusa, gli spin interagiscono, ma a temperatura ambiente la direzione del loro momento magnetico rispetto alla particella oscilla rapidamente(Brown, 1963). Dopo che un campo magnetico esterno allinea i momenti, questo allineamento persiste per un breve momento di tempo per permettere l’interazione. Tali particelle sono chiamate superparamagnetiche(Bean e Livingston, 1959). Sono i trasduttori preferiti per la biostimolazione magnetica(Xu e Sun, 2013; Pankhurst et al., 2009). Le particelle superparamagnetiche possono essere utilizzate come trasduttore di energia del campo magnetico sfruttando due diversi meccanismi: In un forte campo esterno DC, i dipoli magnetici indotti nei NP vicini interagiscono in modo sufficientemente forte da aggregare gli NP e un gradiente di campo esercita una piccola forza(Mannix et al., 2008). In alternativa, il nostro gruppo ha dimostrato che l’applicazione di un campo magnetico alternato (AMF) alle nanoparticelle superparamagnetiche può essere utilizzato per generare localmente calore, che poi attiva i canali TRPV1 sensibili alla temperatura nelle vicinanze(Huang et al., 2010). Questo approccio successivo, quando viene utilizzato per stimolare i neuroni TRPV1+, viene definito “genetica magnetotermica” (Chen et al.,2015; Huang et al., 2010; Stanley et al., 2012).

L’attivazione di un canale richiede il superamento di una barriera energetica leggermente più grande dell’energia di fluttuazione termica (Etica=kBT~4⋅10-21Jat 37°C, con la costante di Boltzmann kB). L’energia massima erogata per ogni particella del trasduttore dipende dal meccanismo di interazione con il campo magnetico. Nel caso di interazione dipolo-dipolo di due NPs con dipolo magnetico m e una distanza r separata, la loro energia di interazione è Ediople~μ0m2/4πr3 (μ0 è la permeabilità al vuoto). In un campo esterno di 0,1 T, il dipolo magnetico di due NPs con nucleo a guscio utilizzati in questo studio è abbastanza forte che il loro Edipole è più grande dell’energia termica non appena sono più vicini a 22 nm(García-Prieto et al., 2016; Zhang et al., 2015a) (Figura1-figure supplement 1A B). Tuttavia, per la ferritina cavallo il dipolo magnetico a 0,1 T per particella è così debole che l’energia di interazione del dipolo è molto più piccola dell’energia termica anche se le molecole di ferritina si toccano tra loro(García-Prieto et al., 2016; Zhang et al., 2015a) (Figura1-figure supplement 1B).

Nella stimolazione magnetotermica, il trasduttore converte l’energia del campo magnetico esterno alternato in calore. Questo processo dipende dalla frequenza f e dall’intensità di campo H del campo magnetico esterno, dal tempo τ durante il quale le fluttuazioni termiche randomizzano l’orientamento dei momenti nella particella, il volume della particella e la magnetizzazione. Le nanoparticelle sintetizzate utilizzate in questo studio, riscaldano di 450 W/g a 500 kHz e 15 kA/m, mentre la ferritina cavallo non riscalda nello stesso AMF (Figura 1-figure supplement 1C). Anche se aumentando la frequenza che guida la ferritina a 50 MHz e 0,15 kA/m la ferritina di cavallo si riscalda meno di 1 W/g. In questo confronto, il prodotto H⋅f è lasciato costante, in quanto è una misura per gli effetti di fondo nei tessuti (Atkinsonet al., 1984; Chen et al., 2015). Quindi, i trasduttori che si accoppiano tramite dipolo-polo o meccanismo magnetotermico, forniscono energia sufficiente se si utilizzano costituiti da NPs superparamagnetici sintetizzati. Questo è in contrasto con la fisica poco chiara della magnetogenetica basata sulla ferritina(Meister, 2016; Stanley et al., 2015; 2012; Wheeler et al., 2016).

Nella stimolazione genetica magnetotermica, il calore deve essere erogato al canale TRPV1 in modo efficiente, evitando un’eccessiva perdita di calore al fluido tampone circostante. Classicamente, il riscaldamento ipertermico a base di nanoparticelle magnetiche utilizza una sospensione densa di nanoparticelle, un ferrofluido, in cui i vicini MNPs schermano il raffreddamento. Un MNP isolato fornisce solo pochi femtowatt di calore, che si disperde rapidamente nel volume dell’acqua. In una matrice bidimensionale densa di MNPs sulla membrana, i MNPs vicini schermano il raffreddamento laterale, lasciando solo la direzione normale alla membrana per la dissipazione del calore. MNP legati alla membrana forniscono una potenza sufficiente per aumentare la temperatura in un foglio sottile lungo la membrana(Huang et al., 2010). Pertanto, abbiamo mirato a utilizzare il riscaldamento AMF di MNP a membrana per evocare il comportamento negli animali svegli.

Qui, riportiamo la prima robusta e ripetuta attivazione genetica magnetotermica del comportamento motorio nei topi svegli, in movimento liberamente utilizzando nanoparticelle magnetiche (MNP), attaccate alla membrana plasmatica dei neuroni TRPV1+ sensibilizzati alla temperatura, in profondità nel cervello. Dimostriamo l’attivazione magnetotermica di successo di tre regioni cerebrali separate, corteccia motoria, striato dorsale e la cresta tra striato dorsale e ventrale. Tutti e tre sono stati precedentemente attivati sia optogeneticamente(Gradinaru et al., 2007; Kravitz et al., 2010) che chimogeneticamente(Arenkiel et al., 2008). Abbiamo osservato le stesse risposte comportamentali che erano state segnalate come risultato di neurostimolazione optogenetica o chemiogenetica in quelle aree. Siamo stati in grado di ottenere la neurostimolazione di successo in vivo senza aumentare la temperatura complessiva del tessuto legando MNPs alla membrana neuronale. Questo metodo magnetotermico non richiede impianti o attacchi fissi, permettendo così una stimolazione ripetibile con il monitoraggio della risposta in tempo reale e la registrazione delle capacità dei topi svegli che si muovono liberamente.

Risultati

Principi di neurostimolazione genetica magnetotermica

Per ottenere una stimolazione neuronale rapida e robusta nei topi svegli, che si comportano liberamente, abbiamo depolarizzato i neuroni sensibili al calore (TRPV1+) attraverso il riscaldamento indotto dal campo magnetico dei MNP superparamagnetici(Figura 1A,B,F). I MNPs sono stati mirati alla membrana neuronale attraverso un anticorpo A2B5 specifico per le proteine di membrana glicosilate neuronali. Questo approccio ha fornito l’etichettatura specifica e densa di membrane neuronali(Figura 1E), riducendo al minimo la quantità di MNPs necessari per l’attivazione.

Sviluppo e sintesi di un trasduttore magnetotermico ottimale

Un efficace trasduttore magnetotermico deve convertire l’energia del campo magnetico alternato in calore in modo efficiente, essere targetable a cellule specifiche e sufficientemente piccolo da potersi diffondere facilmente tra i neuroni nel cervello (<30 nm) (Thornee Nicholson, 2006). MNP con nucleo accoppiato a scambio che combinano materiali magnetici morbidi e duri (ossido di cobalto e ossido di manganese) in una geometria del nucleo del guscio, permettono l’ottimizzazione indipendente delle dimensioni e delle proprietà magnetiche del MNP (Leeet al., 2011; Zhang et al., 2015b). Così, questi MNP possono essere sintonizzati per riscaldare in modo efficiente alle frequenze del campo magnetico, noto per penetrare in modo sicuro nei tessuti (<1 MHz) (Young et al., 1980), mantenendo un diametro inferiore a 30 nm.

Abbiamo sintetizzato MNPs con un nucleo di Co-ferrite di 8,0 ± 1,0 nm circondato da un guscio di Mn-ferrite di 2,25 nm. Per conferire stabilità colloidale in buffer fisiologici, questi MNPs sono stati poi incapsulato nel polimero PMA (dodecil-grafted-poly-(isobutilene-alt-maleic-anidride)(Lin et al., 2008). Il rivestimento PMA aggiunto 5,4 ± 1,4 nm al diametro MNP (Figura 1D). Abbiamo analizzato attentamente le proprietà sperimentali magnetiche e di riscaldamento di questi MNP e abbiamo trovato i risultati di essere ben descritto dalla teoria dei NPs superparamagnetici(Zhang et al., 2015b). L’efficienza di particolari MNPs nella conversione di potenza AMF in calore è misurata e quantificata come perdita specifica di potenza (SLP) in W / g. Gli MNP utilizzati in questo studio hanno una SLP di 733,3 ± 2,8 W/g a 37,0 kA/m e 412,5 kHz, vicino al massimo teorico per particelle di queste dimensioni (Zhang et al., 2015a).

Per indirizzare gli MNP specificamente ai neuroni, li abbiamo funzionalizzati con NeutrAvidin che poi si lega agli anticorpi biotinilati. Abbiamo usato o anticorpi contro i marcatori di superficie neuronali endogeni, come anti-CD56 (Thy-1), anti-CD90 (NCAM) o anti-A2B5, o contro un tag proteico fluorescente. Il più tardi ha permesso il targeting genetico di cellule specifiche, esprimendo transitoriamente una proteina di superficie con una GFP extracellulare o mCherry(Figura 1-figure supplemento 2A e B).

L’aumento di temperatura locale in prossimità delle nanoparticelle è stato misurato con variazioni di intensità di fluorescenza di un fluoroforo Dylight 550 integrato nel rivestimento di NeutrAvidin. Le intensità di fluorescenza dei fluorofori molecolari sono sufficientemente dipendenti dalla temperatura per fornire un termometro a scala molecolare(Huang et al., 2010). Abbiamo scoperto che l’intensità di fluorescenza di DyLight 550 è diminuita del 2,2% per ogni aumento di temperatura di grado(Figura 1-figure supplement 3).

Le nanoparticelle legate alla membrana hanno prodotto un riscaldamento efficiente e ben localizzato

Per aprire un numero sufficiente di canali TPRV1 per influenzare la cottura neuronale, la temperatura della superficie cellulare deve aumentare solo di pochi gradi al di sopra della temperatura fisiologica(Huang et al ., 2010; Chen et al., 2015). In primo luogo, abbiamo determinato l’efficacia di AMF-driven riscaldamento guidato di MNPs in sospensione, alias ferrofluido, e poi separatamente di MNPs a membrana, utilizzando identiche condizioni sperimentali e AMF(Figura 2). La temperatura del bagno è stata misurata in continuo utilizzando un termometro a fibre ottiche immerso(Figura 2A), mentre la temperatura della membrana è stata misurata utilizzando l’intensità di fluorescenza di DyLight 550 integrato nel rivestimento NeutrAvidin della membrana legata MNPs(Figura 2B). L’AMF (22,4 kA/m a 412,5 kHz) è stato generato in una bobina costruita su misura, raffreddata ad acqua, che circonda il piatto campione, che è stato montato su un microscopio invertito.

Nel campione di sospensione MNP sospensione, la temperatura dell’intero bagno (insieme con le cellule) è aumentato di due gradi(Figura 2C). Dopo un riscaldamento AMF sette secondi, la sospensione MNP ha richiesto più di 1 minuto per raffreddare alla temperatura iniziale. Al contrario, quando i MNP sono stati legati alla membrana cellulare, solo la membrana, e non il bagno, è stato riscaldato di diversi gradi(Figura 2D). Dopo aver rimosso l’AMF, la temperatura della membrana è tornata al valore iniziale in pochi secondi. Quindi, utilizzando MNPs legati alla membrana fornisce una precisione temporale di pochi secondi per terminare la neurostimolazione magnetotermica.

I tassi di aumento della temperatura dipendono dalla concentrazione di MNPs. Per varie concentrazioni di volume di MNPs abbiamo misurato tassi da 0,1 a 0,5°C/s (Figura 2E). Per i MNP a membrana, i tassi sono stati 0,1 a 1,0 ° C / s, a seconda della densità di area di MNP (Figura 2F). Tracciare la velocità di riscaldamento in funzione della concentrazione di MNP crolla queste misure. Per il riscaldamento in sospensione, la velocità di riscaldamento dipende linearmente dalla concentrazione di MNP ed è adatta a 5,8 × 10-4 ± 1,9×10-6°C^.µm3/s (Figura 2G). Quindi, la potenza di riscaldamento per MNP è di 2,55 ± 0,94 fW/particella, coerente con la previsione delle misurazioni magnetiche, 3,34 fW/particella (Zhang et al.,2015a). Nel caso della membrana, il grafico della velocità di riscaldamento rispetto alla densità di area MNP è adatto a 1,1 × 10-3 ± 6,7×10-5^C.µm2/s(Figura 2H). Confrontando l’adattamento ottenuto per il riscaldamento della membrana con il riscaldamento della sospensione, si nota che il volume di acqua riscaldata nel caso della membrana corrisponde ad una lastra di 0,5-µm di spessore della sospensione MNP. In realtà, la temperatura lontano dalla membrana scende inversamente con la distanza dalla membrana(Baffou et al., 2013). Figura 2I e J visualizzare la spaziatura MNP per i casi di membrana e sospensione, assumendo una distribuzione omogenea MNP.

Per determinare un limite inferiore per l’intensità di campo di AMF richiesto per il riscaldamento locale della membrana, abbiamo confrontato l’aumento della temperatura della membrana in cellule HEK decorate con MNP a due diverse intensità di campo, 12 kA/m e 30 kA/m (entrambi a 412 kHz). Un’applicazione di 30 s dell’AMF più debole ha riscaldato la membrana tanto quanto un’applicazione di 5 s dell’AMF più forte(Figura 2-figure supplement 1). Tuttavia, a 12 kA/m AMF, una volta che la temperatura locale è aumentata di oltre 2°C sopra l’ambiente, il raffreddamento all’ambiente diventa paragonabile al riscaldamento. Quindi, anche durante le applicazioni AMF più lunghe, l’aumento massimo della temperatura locale rimarrà in un intervallo di sicurezza per le celle.

Nel complesso, abbiamo trovato che per le MNP a membrana, la durata di AMF per raggiungere l’aumento di due gradi necessario per attivare i canali TPRV1 varia tra 2,1 s e 4,2 s(Figura 2F). La quantità di MNP necessaria per velocità di riscaldamento simili nel riscaldamento in sospensione è di pochi ordini più alta, 20-30 mg/ml (Figura 2E – H).

Attivazione termica dei neuroni ippocampali TPRV1 + ippocampali

Per misurare la risposta dei neuroni ippocampali TRPV1+ alla stimolazione termica, abbiamo usato l’indicatore di calcio veloce geneticamente codificato GCaMP6f(Chen et al., 2015; Grewe et al., 2010), e abbiamo deconvolto i transitori Ca2+ per scoprire il treno di picco sottostante(Figura 3-figure supplement 1). In primo luogo, abbiamo indagato il tasso di cottura spontanea di 10 giorni vecchi neuroni ippocampali TRPV1 + ippocampali attraverso una gamma di temperature di bagno fisiologicamente rilevanti. Da 32 ° C a 36 ° C, il tasso di picco di calcio era indipendente dalla temperatura. Come temperatura del bagno è stato aumentato da 37 ˚ C a 39 ˚ C, l’attività spontanea dei neuroni TRPV1 + neuroni è aumentata da 1,5 ± 1,2 potenziali d’azione (APs) per 5 s a 13 ± 3 APs nello stesso periodo. A 39°C, solo il 15-20% circa dei canali TRPV1 del ratto si aprono (Grandlet al., 2010), ma l’afflusso di calcio che ne risulta è sufficiente a innescare l’attività neuronale perché il TRPV1 ha una conduttanza a canale singolo circa 1.000 volte superiore a quella del ChR2 (Lórenz-Fonfríae Heberle, 2014; Studer e McNaughton, 2010). Nei neuroni di controllo, senza TRPV1, abbiamo osservato una leggera diminuzione del tasso di picco, a 1 ± 1 APs per 5 s (Figura 3A). L’analisi dettagliata dei singoli transitori di calcio in assenza di TRPV1, e con TRPV1 a temperature di attivazione del canale ha mostrato, che, all’interno della risoluzione di GCaMP6f basato su calcio imaging, l’attività TRPV1 non cambia la forma del transitorio di calcio e l’AP sottostante(Figura 3-figure supplement 1). Pertanto, esprimendo di TRPV1 in neuroni ippocampali rende il loro tasso di cottura altamente sensibile al calore senza interrompere la funzione naturale.

Il riscaldamento MNP localizzato a membrana stimola i neuroni dell’ippocampo in coltura

Per misurare la stimolazione evocata dal riscaldamento MNP, abbiamo trasfettato i neuroni ippocampali coltivati con TRPV1 e GCaMP6f, quindi abbiamo decorato la membrana plasmatica con MNP. La fluorescenza rossa dei MNPs etichettati DyLight550 è stata rilevata lungo tutta la membrana neuronale, indicando una buona etichettatura superficiale(Figura 1E).

Quando esposto ad un AMF (22,4 kA / m a 412,5 kHz, 5 s), MNP decorato TRPV1 + neuroni MNP ha mostrato un aumento di picco, misurata come transitori di calcio(Figure 1F e 3B). Il treno di picco di ogni neurone è stato derivato dai transitori di calcio registrati, convolgendo un treno di picco stimato con il segnale di calcio GCaMP6f registrato di un singolo potenziale d’azione; quindi calcolando il residuo tra la traccia di calcio misurata e quella calcolata; e regolando il treno di picco stimato per minimizzare il residuo (vedere Materiali e metodi e Figura 3-figure supplement 1) (Yaksi e Friedrich, 2006). Rispetto all’attività basale (1,8 ± 0,6 APs) durante 5 s prima dell’applicazione AMF, il picco è aumentato significativamente a 4,5 ± 1,2 APs durante l’AMF 5 s (p = 0.0028, non accoppiato T-test), e 12,1 ± 2,0 APs nel 5 s dopo che l’AMF è stato rimosso (p = 0,0002, non accoppiato T-test) (n = 13 cellule, tre culture) (Figura 3D, Figura 3-figuresupplemento 2) . Durante l’applicazione AMF, la temperatura della membrana dei neuroni TRPV1+ decorati con MNP è aumentata di 2°C, come misurato dalla fluorescenza DyLight550 (Figura 3C). La stimolazione è molto riproducibile con 87,5% delle cellule che rispondono alla seconda stimolazione, dopo 5 minuti dopo il primo.

Latenza e la consistenza della stimolazione magnetotermica

Abbiamo analizzato la consistenza dell’attivazione, l’aumento della velocità di cottura e del numero di cellule attive, così come la latenza di attivazione. La Figura 3E mostra la latenza di attivazione, il ritardo temporale tra l’inizio dell’applicazione sul campo e il primo evento di spiking, per tutte le stimolazioni registrate (79 neuroni, 6 colture, varie durate di AMF). L’87% dei neuroni aumenta durante i primi 5 s di applicazione del campo, e il 64% dei neuroni si attiva già entro 2 o 3 s dopo l’accensione del campo(Figura 3E). Un istogramma delle latenze di tutte le cellule esposte a 5 s di stimolazione del campo è stato dotato di una distribuzione di Poisson dando un valore di aspettativa di 2,18 ± 0,17 s (Figura 3F). Questi dati mostrano la più veloce stimolazione magnetotermica fino ad oggi(Chen et al., 2015; Huang et al., 2010). Successivamente, abbiamo determinato se la stimolazione magnetotermica è anche in grado di attivare i neuroni quiescenti, che non erano già vicino alla soglia di depolarizzazione. Abbiamo definito come attivi i neuroni con almeno un transitorio di calcio durante un periodo di 5-s. In condizioni basali, 53,7 ±1,6% dei neuroni erano attivi nelle culture. Cinque secondi AMF applicazione AMF aumentato la popolazione attiva a 80,5 ± 5,1% dei neuroni (Figura3G). Abbiamo dimostrato che 5 s di stimolazione magnetotermica non solo aumenta i tassi di cottura dei neuroni già attivi (Figura 3D), ma aumenta anche la percentuale di cellule attive in una popolazione (Figura 3G).

La stimolazione genetica magnetotermica della corteccia motoria ha evocato i topi a correre lungo la periferia dell’arena

Abbiamo poi verificato che la stimolazione genetica magnetotermica termica nel cervello potrebbe essere specifica e sufficiente per evocare un comportamento preciso in un animale sveglio e in movimento. Il nostro obiettivo era quello di evocare una risposta nei topi svegli e in movimento, che potesse essere facilmente e rapidamente rilevata. L’accensione e lo spegnimento ripetibili con latenze ragionevoli dimostrerebbero la causalità. In particolare, abbiamo scelto diverse risposte motorie che sono state precedentemente evocate con l’attivazione chemiogenetica o optogenetica.

Successo di successo di attivazione della corteccia motoria secondaria motore evocazione in esecuzione è stato segnalato utilizzando l’optogenetica(Gradinaru et al., 2007). Abbiamo cercato di riprodurre queste risposte, utilizzando la stimolazione magnetotermica dei neuroni della corteccia motoria(Figura 4-figure supplemento 1). Mentre una certa espressione di TRPV1 nel cervello del roditore è stato segnalato(Basbaum et al., 2009), la stimolazione genetica magnetotermica robusta richiede uniforme, sostenuta sovra-espressione di TRPV1 nei neuroni bersaglio. Abbiamo ottenuto la sovraespressione di TRPV1 nella corteccia motoria del topo consegnando il sierotipo 5 del virus adeno-associato (AAV5) come veicolo per il transgene TRPV1 sotto il promotore neuronale specifico della sinapsiina-1 hSyn (AAV5-hSyn-TRPV1) mediante iniezione stereotassica(Kügler et al., 2003). Tuttavia, AAV è troppo piccolo per confezionare un vettore, codificando TRPV1 e un marcatore proteico fluorescente. Quindi, per alcuni esperimenti, abbiamo anche creato un lentivirus che porta i geni per TRPV1 e una proteina fluorescente rossa con sequenza di targeting nucleare dietro un sito di ingresso ribosoma interno (EF1a-TRPV1-IRES-DSRed). Entrambi, AAV5 e lentivirus, hanno portato a una robusta espressione in vivo, permettendo la stimolazione di un comportamento specifico.

I neuroni della corteccia motoria sono stati sensibilizzati al calore, iniettando unilateralmente AAV5-hSyn-TRPV1(Carvalho-de-Souza et al ., 2015; Lein et al., 2007). Due o quattro settimane dopo, 500-600 ng di MNP coniugati con anticorpi sono stati iniettati nella stessa posizione. (AP = 1, ML = 0.5, DV = 0.5 (tutti in mm)). Utilizzando immuno-istologia, abbiamo confermato l’espressione del TRPV1 indotta da virus e il legame di MNPs ai neuroni nell’area della corteccia motoria bersaglio(Figura 4-figure supplement 2).

Tutti i topi 6 in un totale di 14 prove ha iniziato a correre lungo la periferia dell’arena di osservazione (AMF era 7,5 kA / m e 570 kHz; Figura 4A, B, Figura 4-figure supplemento 3). Per illustrare il contrasto tra i comportamenti indotti e quelli a riposo, la traccia della testa (colore contrassegnato per il riconoscimento automatico degli oggetti) di un mouse rappresentativo è mostrato in Figura 4C. La corsa lungo la periferia dell’arena circolare, registrata durante l’applicazione sul campo (mostrato in rosso)(Video 1) è in netto contrasto con le tracce di esplorazione / riposo, osservate in assenza di AMF. I dati di controllo acquisiti dallo stesso mouse prima dell’iniezione MNP, e di nuovo tra una prova e l’altra hanno mostrato una locomozione più lenta orientata in modo casuale, non limitata alla periferia(Video 2). Poco dopo l’inizio dell’applicazione AMF, il mouse ha iniziato a funzionare, che ha rallentato rapidamente dopo che l’AMF è stato rimosso(Figura 4D). La velocità lineare del mouse è aumentata da 5,3 ± 2,75 mm/s a 83,8 ± 3,75 mm/s (Figura 4E; un mouse, quattroprove, p=5,9-10-6, 95% C.I. [0,9, 9,7] e [77,8,^{89,8] mm/s}). La velocità angolare è aumentata da 0,21 ± 0,19 giri/min a 3,27 ± 0,30 giri/min (Figura 4F; p=0,0003). In tutte le 14 prove in 6 topi, la velocità angolare è stata significativamente più veloce durante le applicazioni AMF, 2,81 ± 0,20 giri/min, rispetto a 0,34 ± 0,08 giri/min durante i periodi di riposo tra i campi (Figura 4G; p=5,2-10-9; 95% C.I. [0,29, 0,39] e [2,69,^2,93] giri/min). La figura 4-figure supplement 1 mostra sette risposte individuali alla simulazione (quattro topi). In tutte le prove abbiamo osservato una forte risposta in corsa, ma alcuni topi hanno cambiato direzione occasionalmente. Quindi, tracciamo la distanza angolare percorsa, oltre allo spostamento angolare.

La stimolazione ripetuta dello stesso animale evocava un aumento della locomozione in modo affidabile in ogni prova. La Figura 4D mostra quattro applicazioni sul campo da 1 minuto in una prova di 15 minuti. Sessioni ripetute sugli stessi topi dimostrano che la sensibilizzazione persiste per diversi giorni(Figura 4-figure supplement 4). C’è una stretta correlazione temporale tra il riscaldamento AMF ed il comportamento osservato: Ogni volta, poco dopo l’applicazione dell’AMF, il mouse inizia a correre. La deambulazione stimolata persiste per tutta la durata dell’applicazione sul campo e termina poco dopo che l’AMF è stato rimosso. Per una forza AMF di 7,5 kA/m rms a 570 kHz, la risposta comportamentale è iniziata 22,8 ± 2,6 s (n = 14, 6 topi, Figura 4H) dopo l’inizio dell‘AMF. Questa latenza di insorgenza del comportamento è coerente con la rapida risposta in vitro, perché il riscaldamento dipende dal quadrato della forza dell’AMF, che per il caso in vivo era circa un terzo di quello degli esperimenti in vitro. Esecuzione di riscaldamento AMF su MNP decorato cellule HEK decorato ha mostrato che abbassando l’intensità del campo di un terzo ha aumentato il tempo necessario per raggiungere un aumento di due gradi a 20 s(Figura 2-figure supplemento 1). Il ritardo è paragonabile a stimolazioni optogenetiche nella corteccia motoria, anche utilizzando virus consegnato geni attivatore(Airan et al., 2009). Dopo che l’AMF è terminato, il comportamento di deambulazione è continuato per 14,7 ± 2,5 s, probabilmente il tempo necessario per raffreddare la membrana legata MNPs (Figura 4H). L’utilizzo di nanoparticelle legate alla membrana per la neuro-stimolazione magnetotermica garantisce una veloce cinetica on e off perché solo un minuscolo volume di spazio viene riscaldato e raffreddato.

Topi iniettati con solo AAV5-hSyn-TRPV1 virus o solo MNPs non ha mostrato alcuna risposta all’applicazione AMF(Video 3 e 4 rispettivamente) dimostrando che né l’iniezione MNP né l’espressione TRPV1 MNP da sola è sufficiente per evocare la risposta. Stimolazione osservabile si è verificato solo quando AMF è stato applicato in presenza del canale ionico temperatura-gated, TRPV1, e l’energia trasduttore MNPs nelle stesse posizioni del cervello. Per gli animali privi di iperespressione TRPV1 o MNP, l’applicazione AMF non ha causato alcuna deviazione significativa dalla velocità di rotazione di base speedEquation (quattro topi singoli per ciascuno, Figura 4I). D’altra parte, in tutti i topi iniettati sia con MNP e TRPV1 nella stessa posizione cerebrale, la velocità angolare è aumentata significativamente con AMF, 3,17 ± 0.17 giri/min rispetto alla velocità di base di 0,42 ± 0,07 giri/min (n = 10, p = 1,1-10-5; T-test non accoppiato; 95% C.I.^{[0,32, 0},52] e [2,94, 3,40] giri/min) (Figura 4I). Membrana di targeting i MNPs è essenziale come animali iniettati con virus e MNPs senza l’anticorpo anti-A2B5 erano insensibili all’applicazione AMF(Figura 4I, Figura 4-figure supplement 3).

Stimolazioni genetiche magnetotermiche cerebrali profonde nello striato causano la rotazione intorno all’asse del corpo

Successivamente, abbiamo studiato l’efficacia della stimolazione genetica magnetotermica nello striato, una regione cerebrale profonda. L’attivazione chemogenetica dei nuclei di putamene caudato nello striato ha dimostrato in precedenza di evocare un aumento della locomozione sotto forma di rotazione intorno all’asse del corpo(Arenkiel et al., 2008; Kreitzer e Malenka, 2008). Per replicare questi risultati con la stimolazione magnetotermica, abbiamo iniettato il virus AAV5-hSyn-TRPV1 e MNPs nel caudato putamen nuclei nello striato dorsale, 3 mm di profondità (AP = 0, ML = 2,3 da bregma) (Li et al., 2015; Ohet al., 2014). L’istologia immunologica ha confermato il successo della sovra-espressione TRPV1, l’iniezione di MNP al bersaglio(Figura 5-figure supplements 1,2), e una buona sovrapposizione di entrambi (Figura 5-figure supplement 3. Durante l’applicazione AMF, il mouse gira intorno al suo asse del corpo, in modo che la sua testa traccia cerchi di 22 ± 5 mm di raggio (Figura 5A-C,Video 3). Questi giri sono stati molto regolari e veloci (19,3 ± 2,2 mm/s; Figura 5D), con il risultato di 4,7 ± 0,8 giri al minuto (Figura 5E). Questo comportamento è stato molto diverso dal movimento di corsa osservato durante l’attivazione della corteccia motoria, dove i topi correvano a velocità di 83,8 ± 3,75 mm/s, vicino al bordo dell’arena, che ha un raggio di 50 mm. In questo caso, i raggi di rotazione dei cerchi fatti dai topi erano considerevolmente più piccoli, e la velocità lineare più bassa. Il movimento di virata evocato dalla stimolazione nello striato era molto riproducibile di prova in prova e attraverso gli animali(Figure 5F, 12 prove, 4 animali). I topi si sono rivolti controlaterali all’iniezione in 11 delle 12 prove e non hanno mai invertito la direzione di rotazione dopo aver iniziato il movimento.

La risposta media di quattro topi striati in 12 prove è stata un aumento di 6 volte della velocità angolare durante l’attivazione AMF, 2,86 ± 0.19 giri/min rispetto ad un tasso di base di 0,47 ± 0,09 giri/min (Figura 5G; p = 3,4-10-7; T-test non accoppiato;^{95% C.I}. [0,42, 0,56] e [2,71, 3,01] giri/min). La risposta osservata è coerente con una precedente relazione di stimolazione dello striato dorsale mediante attivazione capsaicina dei canali TRPV1 alle stesse coordinate cerebrali(Arenkiel et al., 2008).

Oltre alla prova di stimolazione multipla durante una sessione, abbiamo eseguito diverse sessioni con successo oltre 54 ore(Figura 5-figure supplemento 4).

Stimolazione genetica magnetotermica cerebrale profonda sulla cresta tra lo striato dorsale e ventrale provoca il congelamento dell’andatura

Per evocare magnetotermicamente una risposta che non comporti un aumento della locomozione, abbiamo voluto dimostrare la stimolazione del congelamento dell’andatura. Il team Deisseroth ha dimostrato che la stimolazione optogenetica vicino alla cresta tra lo striato dorsale e ventrale inibisce la locomozione volontaria(Gradinaru et al., 2009; Kravitz et al., 2010). Pertanto, abbiamo approfittato del fatto che la profondità di stimolazione è limitata solo da accessibilità regione cerebrale in termini di virus e la consegna MNP, e iniettato AAV5-hSyn-TRPV1 virus AAV5-hSyn-TRPV1 e MNPs alla cresta tra striato dorsale e ventrale (AP = 0,01, ML = 2,3) (Figura 6-figuresupplemento 1). L’applicazione dell’AMF ha causato il congelamento dell’andatura (FOG), caratterizzato dall’inibizione della locomozione, con tutte e quattro le zampe bloccate in posizione mentre il topo era ancora in grado di muovere la testa in tutte le direzioni, collo in avanti. La FOG è comune nei pazienti con malattia di Parkinson avanzata (Mooreet al., 2008). I video 6 e 7, Figura 6A-C mostrano le tracce del collo del topo. Le attività ambulatoriali sono diminuite notevolmente durante la stimolazione, che può anche essere visto dalle tracce della zampa(Figura 6-figure supplement 2). Oltre alla FOG, c’è stato un eccessivo allungamento verso l’esterno degli arti insieme all’incapacità delle estremità anteriori di seguire il movimento della testa(Figura 6D). Durante l’applicazione AMF, la velocità lineare media è diminuita significativamente, da 17,7 ± 2,2 mm / s prima della stimolazione a riposo essenzialmente, 1,04 ± 0,13 mm / s (Figura 6C; due topi, sei prove;p = 0,0006; non accoppiato T-test; 95% C.I. [15,4, 20,1] e [0,90, 1,18] mm / s). La velocità tracciata durante l’AMF era indistinguibile da quella di un marcatore fisso sul pavimento dell’arena (0,52 ± 0,11 mm/s).

Discussione

Il nostro lavoro dimostra che la stimolazione genetica magnetotermica può efficacemente attivare specifici circuiti neuronali in topi svegli e in libero movimento per evocare comportamenti definiti in modo rapido, robusto e ripetuto. Tre diversi circuiti e comportamenti sono stati stimolati magnetotermicamente e confrontati con la stimolazione optotermica o chemiogenetica precedente degli stessi circuiti: in esecuzione, in risposta alla stimolazione della corteccia motoria (lavoro optogenetico precedente:[Gradinaru et al., 2009]); rotazione intorno all’asse del corpo, dopo la stimolazione in profondità nello striato (lavoro chemiogenetico precedente:(Arenkiel et al., 2008); e il congelamento dell’andatura, in risposta alla stimolazione sulla cresta tra lo striato dorsale e ventrale (precedente lavoro optogenetico:[Kravitz et al., 2010]). Abbiamo evocato con successo comportamenti opposti, la corsa o il congelamento dell’andatura, mirando lo striato dorsale o la cresta tra lo striato dorsale e ventrale, rispettivamente, le posizioni nel cervello solo 1 mm di distanza l’uno dall’altro. Questo dimostra chiaramente che il comportamento evocato è il risultato della stimolazione di un circuito neuronale specifico, e che il calore generato dal MNPs in risposta al AMF è sufficientemente localizzato ai neuroni bersaglio.

La stimolazione genetica magnetotermica porta rapidamente al comportamento motorio mirato, osservabile entro 15-20 s dall’attivazione dell’AMF. Questo breve ritardo non è un limite intrinseco della tecnica, ma piuttosto il risultato di un debole campo medio nel sito della testa del topo(Figura 4-figure supplement 5). Poiché la velocità di riscaldamento è proporzionale al quadrato dell’intensità del campo magnetico, il triplice campo più debole ha causato nel topo una latenza circa nove volte superiore a quella osservata negli studi in vitro. È tecnicamente possibile generare campi elettromagnetici sufficientemente grandi da ridurre la latenza per la stimolazione magnetotermica del comportamento nei topi a volte solo marginalmente più lenta della stimolazione elettrofisiologica o optogenetica, e significativamente più veloce della stimolazione chimica utilizzando DREADD(Armbruster et al., 2007). Allo stesso modo, i nostri risultati mostrano che il comportamento locomotorio evocato è diminuito rapidamente entro 15 s dopo la rimozione del campo. Uno stretto controllo temporale on- e off-control è vitale per una precisa correlazione della stimolazione del circuito con l’osservazione comportamentale, e finora era stato raggiunto solo utilizzando l’optogenetica, ma non la magnetogenetica o la chemiogenetica.

I brevi ritardi di accensione e spegnimento della stimolazione genetica magnetotermica permettono simulazioni multiple in brevi tempi di osservazione. Nei nostri esperimenti, tre o quattro stimolazioni di un minuto sono state possibili in un esperimento di 10-15 minuti. Tale ripetibilità è fondamentale per ottenere dati comportamentali statisticamente significativi. Altri profili temporali di stimolazione sono facilmente realizzabili, permettendo studi sulla formazione della memoria, o con variazioni nel saggio. La cosa più importante, la stimolazione da diversi secondi a molti minuti è facilmente realizzabile, colmando un importante divario tra l’optogenetica più veloce e la chemiogenetica più lenta.

In questo studio, i MNP sono stati legati tramite l’anticorpo A2B5, che riconosce indiscriminatamente tutte le proteine di membrana glicosilate. Ha prodotto la più alta densità di nanoparticelle sulla superficie cellulare e, di conseguenza, ha ottenuto il riscaldamento più rapido. Tuttavia, abbiamo anche utilizzato con successo anti-CD56 (Thy-1), anti-CD90 (NCAM) per le proteine di membrana endogene, così come anti-GFP per colpire le proteine di membrana marcate con GFP in eccesso. La genetica magnetotermica in tandem con le nanoparticelle legate alla membrana fornisce tre grandi vantaggi: In primo luogo, fornisce una migliore localizzazione e un targeting specifico per i neuroni. La regione di stimolazione è spazialmente meglio confinata in quanto il legame anticorpale limita la distanza che il MNP diffonde nel cervello(Figura 5-figure supplement 5). Inoltre, solo i tipi di cellule con il recettore di membrana specifico bersaglio dell’anticorpo si legano le nanoparticelle(Figura 5-figure supplement 6). In secondo luogo, il riscaldamento è limitato alla vicinanza della membrana. Ciò consente il targeting ortogonale in cui il canale TRPV1 è espresso in un tipo specifico di cellula e gli MNP sono mirati ad un secondo tipo di cellula, e la stimolazione magnetotermica si verificherebbe solo alla loro sinapsi. In terzo luogo, il targeting a membrana fornisce una migliore risoluzione temporale perché solo un minuscolo volume vicino alla membrana viene riscaldato e si raffredda immediatamente dopo la rimozione dell’AMF. Questo fornisce anche meno calore complessivo al cervello. Infine, abbiamo ottenuto un’attivazione robusta con appena 500 ng di nanoparticelle, che è 200 volte inferiore al volume della sospensione di nanoparticelle per la stimolazione dei neuroni cerebrali nei topi anestetizzati(Chen et al., 2015).

Una preoccupazione per la stimolazione magnetotermica può essere che i MNP sia direttamente o attraverso il riscaldamento della membrana inducono la morte cellulare. Abbiamo ripetuto con successo la stimolazione degli stessi animali per sette-otto prove per alcuni giorni senza osservare alcun cambiamento nel comportamento normale o evocato. Inoltre, l’istologia del cervello dopo 20 applicazioni di un minuto AMF, distribuiti in tre sessioni durante un periodo di 24 ore, ha mostrato neuroni decorati MNP intatti(Figura 5-figure supplemento 7). Quindi, se c’è qualche danno, non è rilevabile nell’istologia e nel comportamento. I danni termici possono essere evitati scegliendo l’intensità di campo sufficientemente piccola in modo che il raffreddamento all’ambiente limiti l’eventuale aumento di temperatura a pochi gradi.

Poiché la stimolazione genetica magnetotermica non richiede una connessione fisica con l’animale, offre una libertà senza precedenti nella progettazione di nuovi test comportamentali. Per esempio, diversi animali potrebbero condividere l’arena della stimolazione simultaneamente, e solo gli animali iniettati con MNP sarebbero interessati dall’AMF. Questo fornisce la capacità di studiare gli animali stimolati e non influenzati simultaneamente, sia come controlli che per studiare la loro interazione. L’assenza di un legame o di un impianto ha anche il vantaggio che gli animali non portano alcun marcatore esterno, che può interferire con il normale comportamento del gruppo sociale. Inoltre, esclusiva della stimolazione genetica magnetotermica, la stimolazione avviene solo quando l’animale si trova all’interno del campo magnetico. Quindi, l’adattamento della geometria del campo permette di controllare i tempi e le condizioni di stimolazione. Questo è l’ideale per i saggi che dipendono dallo spazio o dalla posizione, come i saggi di preferenza a più camere, quando gli animali devono essere stimolati solo quando sono in una camera.

Una limitazione dell’attuale implementazione della stimolazione genetica magnetotermica è la potenza necessaria per generare elevati campi elettromagnetici su un grande volume. In questo studio, una fonte di alimentazione di 7,5 kW ha prodotto l’AMF su un volume di 300 cm3. Tuttavia, fonti di energia più forti sono disponibili per produrre AMF in volumi più grandi, sufficienti a coprire l’intero cervello di primati non umani così come gli esseri umani. La stimolazione magnetotermica può fornire un’alternativa all’optogenetica per la stimolazione cerebrale profonda nei primati non umani. In primo luogo, i cervelli di grandi dimensioni si muovono in modo significativo rispetto al cranio, spostando potenzialmente gli elettrodi e le fibre di vetro dal loro obiettivo originale. Poiché il trasduttore per la stimolazione magnetotermica è attaccato alle cellule e non al cranio, la posizione di stimolazione rimane con le cellule originariamente bersaglio. In secondo luogo, l’attivazione del comportamento nei primati non umani può richiedere l’attivazione coordinata di diverse regioni cerebrali distinte e ogni regione può essere più grande del volume coperto da una fibra ottica(Han, 2012; Inoue et al., 2015). La stimolazione genetica magnetotermica può stimolare facilmente più sedi cerebrali distinte, in quanto l’erogazione del MNP è minimamente invasiva e il campo magnetico copre l’intero volume. Il volume effettivamente stimolato può essere controllato dalla quantità di MNP e dal tasso di iniezione. Pertanto, la stimolazione genetica magnetotermica è adatta per la stimolazione cerebrale profonda nei primati non umani.

Proprio come per altre tecniche genetiche, un ostacolo all’applicazione negli esseri umani sarà la preoccupazione per la sicurezza intorno all’iniezione di virus e nanoparticelle nel cervello. Tuttavia, la reazione del corpo alle iniezioni di nanoparticelle è stata ampiamente studiata e può essere minimizzata utilizzando un rivestimento superficiale di nanoparticelle biologicamente compatibile. La chirurgia cerebrale invasiva attualmente utilizzata per iniettare il MNP può essere presto sostituita dalla somministrazione di MNP attraverso il flusso sanguigno, come la recente ricerca ha dimostrato, che gli ultrasuoni focalizzati possono rendere transitoriamente la barriera emato-encefalica permeabile alle particelle di virus(Price, 2015). Nel complesso, la neurostimolazione magnetotermica offre una serie di vantaggi per la stimolazione cerebrale profonda o il silenziamento nei primati non umani e nei primati.

Materiali e metodi

Generazione di campi magnetici

I campi magnetici alternati sono stati generati da bobine raffreddate ad acqua, azionate da un generatore di potenza da 7,5 kW di MSI Automation. Lo strumento è separato in due unità(Figura 1C, Figura 1-figure supplement 4). La fonte di alimentazione (anche l’unità di controllo) era a una certa distanza dal microscopio, mentre lo stadio di testa, su cui è stata montata la bobina di ipertermia, è stato posizionato sopra lo stadio del microscopio attraverso un’apertura nell’incubatrice. La bobina è stata posta direttamente sopra la camera del campione. Circolando acqua raffreddato qualsiasi elemento resistivo nei sistemi. Il campo magnetico per tutti gli esperimenti in vitro è stato generato utilizzando una bobina di rame da 5 mm Ф, cinque giri. Le misurazioni del campo sul sito dei campioni sono state effettuate separatamente utilizzando una sonda magnetica Fluxtrol. Per gli studi in vivo, lo stesso strumento è stato utilizzato per alimentare una bobina di rame raffreddata ad acqua a due giri di 10 mm Ф (Figura 4A, Figura 4-figure supplement 5).

Preparazione di nanoparticelle magnetiche

Le nanoparticelle superparamagnetiche Co-Mn-Ferrite (MNP) con un diametro di 12,5 ± 1,0 nm (Figura 1D) sono statesintetizzate e caratterizzate secondo i metodi pubblicati (Zhang et al.,2015a). Il MNP sono stati trasferiti in acqua mediante rivestimento con PMA (poli-isobutilene-anidride maleica) a seguito di protocolli pubblicati (Lin et al., 2008). I MNP rivestiti con PMA sono stati funzionalizzati applicando covalentemente Neutravidina marcata fluorescente, che potrebbe poi legarsi ad un anticorpo biotinilato.

Sperimentale e teorica caratterizzazione magnetica nanoparticelle

I dati di magnetizzazione della ferritina della milza del cavallo sono stati generosamente condivisi con noi dal Dr. I. Orue (SGIker, Universidad del País Vasco UPV/EHU, 48940 Leioa, Spagna). I dati di magnetizzazione per il core-shell sintetizzato MNP, Co-Mn-Ferrite nanoparticelle (MNP) sono stati misurati anche dal Dr. I. Orue; Figura 1-figure supplement 1A . Per il calcolo dell’energia di interazione dei dipoli magnetici(Figura 1-figure supplement 1), MNP sferici sono stati assunti come dipoli puntiformi, con momenti allineati perpendicolarmente all’asse del dipolo. L’energia di interazione, quindi è data daU (r)=μ04πr3⋅(2μ2)

dove µ è il momento magnetico di singole nanoparticelle separate da una distanza r.

Per il calcolo dei valori di SLP(Figura 1-figure supplement 1), un valore di magnetizzazione di saturazione di 340 µB è stato utilizzato per la ferritina della milza del cavallo. La costante di anisotropia è stata ottenuta dai valori riportati(García-Prieto et al., 2016). La magnetizzazione di saturazione e la costante di anisotropia per i MNP del nucleo del guscio sono state ottenute da misurazioni precedenti(Zhang et al., 2015b). L’intensità del campo magnetico ammissibile per ogni punto di frequenza è stata calcolata utilizzando il limite accettato di attenuazione del campo (e conseguente riscaldamento a correnti parassite nei tessuti)(Atkinson et al., 1984; Chen et al., 2015). La potenza erogata in W/g di particelle è quindi data da:Pparticle=πμ0χ0H02f2πfτ1+(2πfτ)2

Qui, la suscettibilità magnetica χ0 segue l’equazione di Langevin ed è una funzione sia dell’ampiezza del campo magnetico H che T (Rosensweig,2002).

Termometria molecolare

Per misurare il riscaldamento locale vicino alla superficie delle cellule decorate con nanoparticelle, abbiamo utilizzato il fatto che la durata della fluorescenza e l’intensità dei fluorofori molecolari e delle proteine fluorescenti diminuiscono con l’aumentare della temperatura(Figura 1-figure supplement 3).

Etichettatura fluorescente della neutravidina e legame con i MNP

La neutravidina (31000, Thermo Scientific), disciolta in soluzione salina tamponata ai fosfati (PBS) a 2 mg/ml (pH 7,34), è stata etichettata con il colorante estere DyLightTM 550 NHS (62262, Life Technologies), o con il colorante Alexa 647 (A37573, Life technologies) miscelando la soluzione madre di neutravidina con cinque volte l’eccesso molare del fluoroforo e incubata al buio per 2 ore. Il colorante in eccesso (peso molecolare, sotto i 3 kDa) è stato rimosso utilizzando un filtro centrifugo Microcon 10 kDa (EMD Millipore), 8000 r.c.f. I gruppi carbossilici sulla superficie del PMA-MNP (1 mg/ml) sono stati attivati con 0.5 mg/ml di EDC [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimmide cloridrato] (22980, tecnologie Life) e 1,4 mg/ml di Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) (24510, tecnologie Life). Gli MNP attivati sono stati risospesi in PBS, e aggiunti a goccia alla Neutravidina -Dylight 550 o -Alexa 647, in eccesso molare 10 volte. Dopo aver reagito per due ore al buio, la reazione è stata estinta con 10 mM di tampone di idrossilammina. La neutrravidina non legata è stata rimossa lavando MNP in filtri a centrifuga da 300 kDa (8000 r.c.f.).

Microscopia a fluorescenza

Acquisizione di immagini e condizioni di imaging

Le intensità di fluorescenza di GCaMP6f come misura per i livelli di Ca2+, e di DyLight 550 dye (Life Technologies, Carlsbad, CA) come termometro molecolare, sono state registrate utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito (ZEISS AXIO OBSERVER A1.0m). Le cellule cresciute su coprioggetti in vetro da 12 mm sono state fissate in una camera non conduttiva (ALA MS-512DWPW) e poste sullo stadio XY del microscopio. Una camera di incubazione ambientale costruita su misura ha racchiuso il microscopio. La temperatura all’interno della camera è stato impostato prima dell’inizio dell’esperimento e mantenuto stabile a 33,0 ± 1,0 ° C. I fluorofori sono stati eccitati utilizzando una lampada ad arco corto di mercurio HBO 200 con filtri appropriati. L’emissione è stata raccolta con un obiettivo 40x NA 0,75 Zeiss e registrata con una telecamera Andor NEO sCMOS controllata da un software micromanager (Edelsteinet al., 2014). I video continui sono stati acquisiti con un tempo di esposizione di 100 ms a 2 × 2 binning, e salvati come pila di non compressi. File TIFF. L’otturatore Uniblitz electronics VS14S2T0, pilotato dal driver Uniblitz VCM-D1, è stato utilizzato per sincronizzare l’illuminazione della luce di eccitazione con i tempi di acquisizione della telecamera tramite il software micromanager.

Microscopia in campo magnetico alternato

I campi magnetici alternati inducono correnti parassite nell’obiettivo del microscopio metallico, riscaldandolo. L’espansione termica dell’obiettivo può causare distorsioni ottiche e cambiamenti di messa a fuoco. Per correggerle in tempo reale, abbiamo utilizzato un sistema piezoelettrico di autofocus veloce e personalizzato (Motion X Corporation, basato su interferometro laser a 780 nm). Il raggio laser autofocus è stato accoppiato nel percorso ottico del microscopio da uno specchio dicroico, focalizzato attraverso la lente dell’obiettivo sul fondo del coperchio e riflesso nell’interferometro(Figura 1-figure supplement 4). Pertanto, non solo rileva e corregge i cambiamenti nella separazione tra coprioggetti e lente dell’obiettivo, ma anche i cambiamenti ottici interni.

Etichettatura delle celle con MNP

Celle a T HEK 293

Le cellule HEK che crescono su vetrino coprioggetti da 12 mm, 50% confluenti sono state co-trasfettate con plasmidi che esprimono il braccio accettore della biotina AP-CFP-TM el’enzima BirA (p-DISPLAY) (Howarthet al., 2005) (0,4 µg ciascuno). Dopo la trasfezione, 5 uM di biotina sono stati somministrati alle cellule in crescita. 24 ore dopo i coprioggetti sono stati trasferiti alla camera di imaging (ALA MS-512DWPW) in 200 µl di soluzione salina fisiologica (PSS, ingredienti in mM: CaCl2 2, NaCl 151, MgCl2 1, KCl 5, HEPES 10, e glucosio 10, pH 7,3). MNP coniugato con neutravidina-DL550 (0,5 mg/ml) sono stati aggiunti (2 µl). Dopo 5 minuti, il piatto è stato perfuso con tampone PSS per rimuovere le particelle non legate.

Cultura neuronale

Nanoparticelle sono stati mirati alla membrana cellulare neuronale attraverso l’anticorpo IgM biotinilato (433110, Invitrogen). Colture neuronali coltivate su coprioggetti da 12 mm sono state caricate in camera di imaging (ALA scientifico) con 200 µl di tampone di imaging pH.7.34. Anticorpo biotinilato (2 µg / ml) è stato aggiunto, incubato per 10 minuti, prima di essere lavato via da perfusore con tampone HEPES pH 7,3. Nanoparticelle coniugate con neutravidina sono stati poi aggiunti a 10 µg / ml, e dopo 5 minuti le nanoparticelle non legate sono stati lavati via.

Clonazione molecolare e imballaggio virus

Il ratto TRPV1(VR1) in pcDNA3 è stato un regalo del Dr. Julius (UCSF). Il vettore lentivirus pLKO.1-EF1a-TRPV1-IRES-DSRed è stato costruito come segue. Un frammento di TRPV1 pcr (5′ Sal I e 3′ Hpa I) è stato subclonato in pLKO.1-EF1a-IRES-DSRed con un primer 5′ (5′-GCG TCG TCG TCG GTC GAC GCC ACC ATG GAA CAA CGG CGG GCT AGC TTA GAC TC-3′) e un primer 3′ (5′-GCG TCG TCG TCA AGC TTT TAT TTC TTC TCC CCT GGG ACC ATG GAA TC-3′). AAV5-hSyn-TRPV1 è stato costruito generando un frammento di TRPV1 pcr (5′ Sal I e 3′ EcoR I) con 5′ primer (5’GCG TCG TCG TCG TCG GTC GAC GCC GCC ACC ATG GAA CAA CGGG CGG GCT AGC TTA GAC TC-3′) e 3′ primer (5′-GCG TCG TCG TCG AAT TCT TCT TAT TTC TTC TCC CCT GGG ACC ATG GAA TC-3′). Il prodotto TRPV1 pcr è stato clonato in Sal I e EcoR I di pAAV-hSyn-HA-hM4D(Gi)-mCherry un regalo di Bryan Roth (Plasmide Addgene #50475). Tutti i costrutti sono stati verificati in sequenza. Il virus adeno-associato, AAV5-hSyn-TRPV1, è stato generato presso il Virus Vector Core della University of North Carolina a Chapel Hill. Il titolo qPCR era 1,5 × 1012. L’imballaggio del pLKO.1-EF1a-TRPV1-IRES-DSRed plasmid in lentivirus ha seguito i protocolli stabiliti(Boyden et al., 2005).

Esperimenti in vitro sui neuroni

Preparazione dei neuroni

Dopo la trasfezione o nucleofezione, le colture neuronali sono state messe in incubatrice per le successive 24-48 ore per esprimere le proteine. Durante questo tempo, 1 µM TTX (tetrodotossina) è stato aggiunto alla coltura neuronale per ridurre al minimo l’attività endogena. Per l’imaging, il TTX è stato lavato via, ei neuroni sono stati messi in soluzione di Tirode (NaCl 145, CaCl2 2, MgCl2 1, KCl 2.5, HEPES 10, Glucosio 20; tutto in mM). Il buffer di imaging conteneva anche i bloccanti sinaptici DLAP-5 25 µM, NBQX 10 µM, e Gabazina 20 µM, e l’osmolalità è stata regolata a 310-315 mOsmole/L.

Attivazione TRPV1 mediante tampone riscaldato

Le cellule neuronali ippocampali che esprimono transitoriamente GCaMP6f e il ratto TRPV1 sono state studiate per l’attivazione del TRPV1 tramite calore. GCaMP6f ha agito come marcatore per i neuroni nucleofected e come indicatore di calcio geneticamente codificato. TRPV1 attivazione per calore è stato raggiunto da perfusione di tampone di imaging preriscaldato (HEPES 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, KCl 4 mM, glucosio 10 mM). I buffer di perfusione sono stati riscaldati utilizzando un riscaldatore in linea (SH-27B, Warner Instruments) con un feedback di temperatura integrato (TC-324C). La temperatura del bagno è stata monitorata utilizzando la sonda termica ottica Neoptix ReFlex. Una camera di alloggiamento per microscopio costruita su misura ha mantenuto la temperatura ambiente di 33 ± 1,0°C. Come misura di temperatura-driven TRPV1 attivazione guidata dalla temperatura, l’aumento transitorio nel livello intracellulare Ca2 + è stato registrato da GCaMP6f cambiamenti di intensità di fluorescenza GCaMP6f (Figura 1F; Figura 1-figure supplemento 2B; Figura 3B ).

Evocare e osservare il comportamento degli animali

Interventi sugli animali per l’iniezione stereotassica di virus o nanoparticelle

I topi maschi BALB/c (di 3-4 settimane, del peso di 15-20 g) sono stati ottenuti dai laboratori di Harlan, e alloggiati nella struttura per animali vivi (LAF) sotto il ciclo luce-buio di 12 ore in conformità con i protocolli approvati per gli animali dall’Università di Buffalo SUNY Institutional Animal Care.

I topi sono stati anestetizzati con una miscela di ketamina e xilazina (100 mg di ketamina e 10 mg di xilazina per chilogrammo di peso corporeo i.p.). Rupenorfina (0,1 mg per kg di peso corporeo, s.c.) è stato somministrato come antidolorifico pre-operatorio. Il topo anestetizzato è stato montato su un telaio stereotassico (Stoelting) con l’aiuto di barre auricolari e barre dentali. La testa è stata rasata e strofinata con betadine e poi etanolo. La pelle è stata ritratta e il periostio è stato rimosso sul sito. Il cuoio capelluto è stato aperto e il foro è stato praticato nel cranio, attraverso il quale è stato inserito nella corteccia motoria (MC) o striato1 (St1), o St2, a sinistra o a destra (vedi tabella supplementare 1 per le coordinate dell’iniezione). Utilizzando quella siringa e una pompa a siringa automatica (World Precision Instruments), 600 nl virus sono stati infettati ad una velocità di 2 nl/s. L’ago di iniezione è stato sollevato di 0,01 mm e mantenuto in posizione per 5-10 minuti e lentamente rimosso. Il cuoio capelluto del topo è stato suturato e Carprofen antinfiammatorio (5 mg/ml) è stato dato per 2 giorni dopo l’intervento. Tutte le procedure chirurgiche sono state effettuate in condizioni asettiche. Gli animali sono stati ospitati per 2 settimane per consentire l’espressione virale prima di qualsiasi esperimento comportamentale sono stati avviati.

Consegna delle nanoparticelle a sito mirato nel cervello

Moli uguali di MNP coniugati con Neutravidina e anticorpo biotinilato sono stati miscelati a 1 mg/ml. I topi sono stati anestetizzati con Xilazina e Ketamina, fissati in un telaio stereotassico, il periostio rimosso, e il foro pre-perforato dall’iniezione del virus 2-4 settimane prima è stato identificato. Poi, 600 nl di anticorpo MNP-anticorpo sono stati iniettati nello stesso sito dell’iniezione del virus 2 settimane prima, seguendo esattamente la stessa procedura (vedi sopra). La procedura è stata completata entro 45 minuti e i topi sono stati recuperati entro 1 ora, dopo l’anestesia. Gli animali sono stati messi in gabbia fresca e ospitati per 12 ore prima di iniziare l’esperimento.

Registrazione del comportamento degli animali

Per ogni sessione, gli animali sono stati collocati in un’area di osservazione circolare. Le sessioni sono state limitate a 30 min, di cui 10 min assuefazione, e 15-20 min esperimento, durante il quale sono state date tre o quattro applicazioni AMF 1-min lungo.

Una telecamera consumer (Nikon D810) è stata utilizzata per registrare video (HD720, 60fps) dei topi prima, durante e dopo la stimolazione del campo magnetico. Per la risposta di ‘congelamento dell’andatura’ causata dalla stimolazione nello striato, è stata utilizzata una diversa telecamera consumer (SONY DSC-H50) a 20fps. Per ridurre al minimo l’influenza della luce e delle ombre sul comportamento del mouse, i livelli di luce sono stati mantenuti estremamente bassi (sensibilità della telecamera impostata a ISO 12.800). I video (12-18 min di lunghezza, 1,2-2,4 Gb, non compressi) sono stati trasferiti su un computer iMac27′. Sui topi sono stati fatti dei segni rossi con comuni vernici atossiche per dita (Crayola) per facilitare il tracciamento del movimento tramite la visione al computer.

Analisi dei dati di calcio

I filmati di microscopia a fluorescenza sono stati registrati (Micromanager) come stack TIFF e i dati di post-elaborazione e ROI (regione di interesse) sono stati estratti utilizzando FIJI (Fiji Is Just ImageJ). I ROI rilevanti sono stati ritagliati dai file video e la registrazione (utilizzando il plugin Stack Registration) è stata effettuata per eliminare qualsiasi spostamento x-y delle immagini sui fotogrammi video. In seguito, è stata effettuata un’operazione di soglia basata sull’intensità per convertire i pixel di sfondo non dimmerabili a livello cellulare in NAN(Figura 3-figure supplement 1A). Un ROI poligonale è stato poi disegnato per coprire il corpo della cellula. I dati di intensità media (profondità di bit) di tutti i pixel all’interno di quel ROI sono stati salvati con i rispettivi numeri di fotogramma. I dati dell’intensità rispetto al tempo sono stati poi esportati in IgorPro, che è stato utilizzato per ulteriori analisi.

Normalizzazione dell’intensità

Dopo aver importato i dati di intensità media del ROI come onda in Igor Pro, sono stati sottratti i valori di rumore scuro costante da tutti i punti dell’onda. Il rumore scuro è il segnale medio registrato dalla telecamera in assenza di condizioni di illuminazione. Tutti gli esperimenti sono stati fatti nella stessa camera oscura e il valore del rumore scuro si è discostato di poco da un esperimento all’altro ed è per lo più dipendente dai tempi di esposizione della telecamera. Dopo, la cancellazione del rumore scuro, è stata effettuata un’ulteriore sottrazione della linea di base per la correzione del candeggio, se è stato osservato un sostanziale decadimento basato sul candeggio nella linea di base. Per questo, la linea di base è stata adattata ad una funzione esponenziale e si è ottenuto un segnale modificato secondo F(t)=F'(t)+(F'(0)-F’fit(t)). Qui, F'(t) è il valore del segnale ottenuto dopo la cancellazione del rumore scuro e F’fit(t) è la corrispondente funzione di adattamento esponenziale. Il risultato, così ottenuto, è stato normalizzato e convertito in variazione percentuale di fluorescenza. La variazione percentuale dell’intensità di fluorescenza è stata data da:ΔF(t)F0=F(t)-F0F0F0×100

dove, F0 è l’intensità del ROI della linea di base corretta per la candeggina e F(t), l’intensità in qualsiasi momento t.

Stima del singolo picco

Il cambiamento di intensità del GCaMP6f lo rende abbastanza sensibile per il rilevamento del potenziale di singola azione, ma la sua risoluzione temporale non è abbastanza alta da produrre picchi isolati temporalmente corrispondenti ad ogni sparo in un treno AP(Chen et al., 2013). Per estrarre gli eventi di potenziale d’azione da un segnale di fluorescenza GCaMP6f (picchi di Ca2+), abbiamo prima isolato tutti i picchi dai dati normalizzati di intensità corrispondenti a ciascun neurone con un massimo medio di circa il 5% (della linea di base). I picchi sono stati poi mediati e si è creato un profilo medio dei picchi(Figura 3-figure supplement 1B,C). L’onda di picco media è stata poi interpolata linearmente per aumentare la risoluzione temporale a 100 Hz.

Ricostruzione del treno AP

È stata creata un’onda nulla di lunghezza temporale pari a quella dei dati originali, ma di frequenza 100 Hz (a differenza di 10 Hz, per i dati originali). L’onda nulla è stata poi convertita in un’onda binaria, con 1 s nella posizione dei picchi AP stimati(Figura 3-figure supplement 1D,E; barre nere). L’onda di picco singola stimata è stata poi convoluta con l’onda binaria. Una sovrapposizione dei dati normalizzati e la corrispondente ricostruzione basata sulla convoluzione è mostrata in Figura 3-figure supplement 1D,E. Un istogramma del residuo dell’originale e delle onde ricostruite è stato adattato ad una funzione gaussiana. Le posizioni di 1 s nell’onda binaria sono state regolate dinamicamente per ottenere un sigma complessivo inferiore al 2%. L’onda binaria ottenuta dopo l’ottimizzazione ha dato la funzione temporale degli eventi AP per ogni registrazione.

Analisi comportamentale di topi in libero movimento

Tracciamento del movimento

Per tutte le analisi del comportamento del motore, la posizione del marcatore del collo rosso è stata registrata automaticamente utilizzando lo strumento gratuito di analisi video e modellazione TRACKER costruito da Douglas Brown sul framework Open Source Physics Java. Per le risposte motorie attive, è stato analizzato ogni secondo fotogramma, con il risultato di 30 misure di posizione al secondo. Le coordinate prodotte dal tracker sono state trasferite a IgorPro (Wavemetrics) per ulteriori analisi e grafici. Per il tracciamento del movimento della risposta del “congelamento dell’andatura”, la posizione di ogni zampa è stata tracciata ogni 1,2 s e la velocità del mouse è stata calcolata come valore assoluto della velocità lineare media su 3 s. Per altre registrazioni che coinvolgono movimenti rapidi del mouse, la velocità lineare e una velocità angolare sono riportate come media su 500 ms. Per visualizzare il movimento spaziale sono stati generati direttamente dalle coordinate XY grezze XY per visualizzare i diagrammi XY del movimento in finestre temporali selezionate. Per visualizzare il flusso temporale, tracciamo anche le coordinate XY in funzione del tempo.

Montaggio video per la presentazione

I video scelti per la pubblicazione sono stati editati utilizzando il software di editing video VSDC (Flash-Integro) e Lightworks. I video grezzi sono stati compressi utilizzando un encoder H.264 e sono stati ridimensionati a 15 fps e accelerati di 3X per il download e l’osservazione veloce. I segni rossi sul collo sono stati applicati per facilitare il tracciamento del movimento. I periodi di applicazione sul campo sono indicati in basso a destra, mentre i siti di iniezione MNP nel cervello sono indicati in basso a sinistra.

Istologia

Congelati sezioni coronali Rostrali a sezioni cerebrali caudali sono stati preparati seguendo i protocolli standard. Le fette di 75μm di spessore sono stati macchiati per la successiva imaging laser confocale.

Soma e dendriti dei neuroni sono stati contrassegnati con un coniglio anti-microtubuli-associati proteina (MAP2) anticorpo (ab32454, Abcam) (24 ore, 1:500), in combinazione con anti-coniglio IgG Alexa 488 (ab150077, Abcam) (1 ora).

Gli MNP rivestiti con PMA sono stati coniugati con Neutravidina, marcati con ATTO 488. Per aumentare il segnale di fluorescenza, alcune fette di cervello sono stati incubati con Biotin-PEG, etichettato con Alexa 647 colorante (24 ore, 1:500).

AAV5 o lenti-virus è stato utilizzato per la consegna del canale TRPV1 al cervello. Il lenti-virus ha consegnato anche un marcatore nucleare (NLS-mCherry). Poiché l’AAV5 non conteneva alcun marcatore, le fette di AAV sono state incubate con l’anticorpo anti-TRPV1 (ab31895, Abcam), che abbiamo coniugato direttamente con Alexa 647.

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